肿瘤教育血小板联合二代测序技术在肿瘤诊断中的应用

苟葆城，李 萍，马 兵

（川北医学院 四川 南充 637000）

恶性肿瘤是威胁人类生命重要疾病[1]，实现肿瘤的早期、高准确率、微创诊断非常重要。现阶段临床常用肺癌诊断方法可有螺旋CT、PET-CT、血清肿瘤标记物、病理活检。其中螺旋CT对早期肺癌诊断的特异性不高，PET-CT对于直径小于1cm的肺结节缺乏诊断价值，有辐射且价格昂贵，血清肿瘤标记物对肿瘤诊断的灵敏度及特异度均不高，有创的病理活检风险高，且难以重复取检，在精准医疗趋势下的今天已经难以满足更高的诊断需求。在二代测序技术支持下的肿瘤教育血小板（tumor educated platelets, TEPs），被认为是一种有前景的新型液体活检材料，其已经在部分肿瘤的诊断、鉴别诊断甚至早期诊断相关研究中显示出了较好的成果，本文就TEPs联合二代测序在肿瘤诊断中的研究现状进行综述。

1.肿瘤教育血小板与肿瘤

1.1 TEPs的研究背景及来历

从20世纪开始，人们陆续发现肿瘤与血小板之间似乎存在着某种联系，如研究者发现深静脉血栓形成或肺栓塞与随后的癌症发生率增高有关[2]，在肺癌、胃癌、食道癌、宫颈癌、大肠中，血小板增多被认为是肿瘤的不良预后因素[3]。动物实验表明，肿瘤能在体外聚集血小板，并能够增加动物模型体内肿瘤转移，而通过使用血小板GⅡb/GⅢa复合物抑制剂或者减少血小板数量能明显抑制动物模型肿瘤转移[4]，进一步的研究显示，血小板赋予的肿瘤转移性增强可能与血小板抑制了自然杀伤细胞（NK细胞）活性[5]，刺激肿瘤组织血管生成增加[6]，促进肿瘤的上皮向间质转化[7]，甚至抑制肿瘤细胞凋亡等有关[8]。基因组学及蛋白组学的研究显示，肿瘤患者体内的血小板内的RNA可能因为肿瘤组织或肿瘤微环境的改变而发生了肿瘤相关性改变。其机制可能包括肿瘤组织刺激了血小板内premRNA的特异性剪切[9]，或血小板吞噬了含有肿瘤基因的肿瘤微囊泡[10]。

1.2 肿瘤教育血小板概念的提出及用于肿瘤诊断能力的早期尝试

进入21世纪后，分子诊断检查成为一种新的肿瘤诊断方法并逐渐被用于临床，但依靠病理组织为单一材料来源的分子诊断受到制约，为了克服组织获取的局限性，人们开始探索基于血液为检查材料的方法，从而产生了液体活检技术[11]。血小板作为人体内含量最丰富的无核细胞器，其遗传物质主要为来源于巨核细胞的premRNA，具有数量大、易获取、遗传物质相对单一优势。Calverley等[12]人在2010年的研究中运用基因芯片技术对晚期转移肺癌病人及健康人血小板mRNA进行无阵列分层聚类分析，得出的mRNA表达谱在基因表达水平实现了将转移性肺癌与阴性对照区分开。2015年，Best等[13]人运用高通量测序对肿瘤教育血小板mRNA谱的研究实现了区分癌症患者与健康人的准确率为96%，对6种肿瘤类型分型，准确率为71%，在此研究中首次将这些受肿瘤或肿瘤微环境影响而发生遗传物质肿瘤化改变的血小板称为“肿瘤教育的血小板”，由此拉开了TEPS对肿瘤诊断研究的热幕。

2.二代测序技术与肿瘤诊断的联合

二代测序（the next generation sequencing, NGS）又称大规模并行测序或高通量测序，其原理是将DNA分子打断成长约几十至几百bp的片段，将这些片段放入带有荧光标记的反应孔中或固定于芯片上，使用PCR或等温扩增技术进行DNA扩增，通过检测带有不同荧光标记的核苷酸，并将光信号转变为电信号进行读取[14]，相较于既往PCR和基因芯片技术这种“钓鱼式的”单基因模式，二代测序能实现“撒网式的”对某个组织器官的全基因覆盖，具有高通量、效率高、价格相对低廉优点，是继PCR和基因芯片技术后的基因测序领域里程碑进步。现已被广泛用于实体肿瘤驱动基因的检测[15]，其与传统免疫组织化学检测、荧光原位杂交、聚合酶链反应方法相比，能更高效、快速地检测出上述方法不能检测出得少见的突变基因或者发现新的基因突变，从而指导精准用药。该技术应用逐渐成熟，欧盟与美国相继于2015年和2017年发行了二代测序技术应用指南。我国近年来发表了NGS在精准医学、血液肿瘤、肺癌诊断中的专家共识。其他肿瘤如胃肠肿瘤、肝癌、骨瘤等的二代测序专家共识也在形成中。当然，二代测序也有缺点，如单次测量的读长较短，引入PCR会在一定程度上增加测序的错误率，并具有系统偏向性，这一缺陷未来有望在三代测序中得到弥补，其次，二代测序在技术操作、数据管理以及结果解释上有较高的要求，这些都是该技术能否很好应用的关键[16]。

3.二代测序在肿瘤教育血小板中的应用

RNA-seq也称为转录组测序技术，利用高通量测序技术研究转录组在全面快速得到基因表达谱变化的同时，还可以通过测定的序列信息精确地分析转录本的cSNP（编码序列单核苷酸多态性）、可变剪接序列，对检测低丰度转录本和发现新转录本具有优势。运用该技术研究血小板RNA的表达水平差异及表达谱的差异成为TEPs研究的热门方向，目前国内外已利用此技术发表多篇利用此技术实现了血小板内RNA成分对肿瘤的诊断、鉴别诊断有价值的文献。得出部分肿瘤的基于二代测序的TEPS肿瘤标记物，最著名的是Best等[13]人研究中用TEPS RNA谱实现了对肿瘤与非肿瘤区分，准确率为96%，对包括非小细胞肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、肝胆癌和乳腺癌的六种不同肿瘤类型分型，准确率为71%。另有单独的研究用于区分神经胶质瘤与健康人的达到95%的检测准确度[17]，区分肉瘤和非肉瘤样本诊断准确率达到87%[18]的报道。如我国学者薛琳琳等[19]人在2018年发表的一篇文章中通过对5例肺癌患者及5例健康人血小板中差异表达的RNA谱进行研究，发现了204个差异表达显著的RNA，其中185个在肺癌患者样本中表达上调，19个下调，而且提出这些基因功能注释可能与转录后调节和剪接体剪接代谢有关，另有中国学者在2019年报道了TEPs RNA对早期非小细胞肺癌诊断与鉴别肺良性结节的鉴别中表现出了价值[20]。

4.结论

综上所述，血小板是肿瘤发生发展过程中的中心参与者，已知血小板存在促进肿瘤进展、转移的能力，但具体机制尚不完全清楚，通过基因层面找出致病基因然后反推其致病机制不失为一个好的方法，能以高效、快速、低成本实现对血小板全部RNA的检测，二代测序技术正好满足了TEPs肺癌诊断的发展需求。目前，二代测序技术越来越多的用于转录组测序，如上所述，其用于肿瘤的前期研究已经取得了很好的效果，接下来需要更大规模的临床研究及数据支持这种新的液体活检方法，二代测序技术仍将大大的发挥它的用处，当然，我们也期待第3、4代测序技术的普及应用的到来。