基于TDLAS技术测定水稻种子呼吸的初步研究

郑 雯，贾良权，祁亨年，王瑞琴，赵光武，袁 俊

(1.浙江农林大学 信息工程学院，浙江 杭州 311300； 2.湖州师范学院 信息工程学院，浙江 湖州 313000)

种子呼吸是种子的重要生理现象，研究种子呼吸对了解种子活力、种子代谢、种子萌发等生理生化过程具有重要意义。处于不同生理状态的种子，其呼吸强度与性质有很大的差异，同一条件下，呼吸强度的大小可以反映种子活力的强弱[1-2]。因此，可以通过研究种子的呼吸强度来确定种子的活力水平。

传统的种子呼吸检测方法主要有：小篮子法、Warburg法、红外线CO2分析仪法[3]和Q2氧传感技术[4-6]等。刘玉杰等[7]采用小篮子法，用Ba(OH)2溶液吸收种子呼吸产生的CO2，再利用草酸溶液滴定剩余的Ba(OH)2溶液，从空白和样品二者消耗的草酸溶液之差，计算出种子呼吸过程中释放的CO2的量，在教学实验中广泛使用；王亚文等[8]采用Warburg法，将种子放入反应瓶中，利用KOH溶液吸收CO2气体，种子呼吸吸收氧气导致压力降低，测压计显示压力值，从而得到种子呼吸过程中的耗氧量；潘威等[9]利用Q2氧传感技术分析了烟草种子萌发过程中的呼吸代谢情况，利用Q2氧传感技术提供的呼吸代谢指标来指示烟草种子活力。传统方法主要利用广口瓶等仪器收集CO2排放总量的方法进行测量，该方法一方面由于检测精度低、分辨率不够，需要大量种子样品；另一方面须对样品进行长时间收集以增加CO2的浓度，从而造成测量、分析的工作量大，并且难以进行连续、动态、高时间分辨率的实时在线监测，在实际应用中存在一定的局限性。

可调谐二极管激光吸收光谱技术(TDLAS)具有检测精度高、响应速度快、动态非接触测量等优点，被广泛使用来测量CO2等痕量气体[10]。本文基于种子呼吸特点，提出将TDLAS测量痕量气体技术应用于种子呼吸CO2浓度检测，设计了一款高检测限的种子呼吸检测系统，对不同浸泡时间下以及不同收获期的水稻种子呼吸产生的CO2浓度进行检测，并对同一批种子进行发芽试验。采用TDLAS技术检测水稻种子的呼吸强度，分析种子呼吸强度与发芽率、发芽势、发芽指数、淹水3 d发芽率及田间出苗率等种子活力指数的相关性，以期为利用种子呼吸进行种子活力等级检测提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

不同活力水稻种子由湖南隆平种业有限公司提供，置于4 ℃贮藏备用。品种为‘梦两优黄莉占’籼型杂交水稻，授粉结束日为2018年8月22日，分别在当年9月4日、9月7日、9月9日、9月11日和9月13日5个时期收获种子，并分别编号A1、A2、A3、A4和A5。

1.2 方法

本文基于种子呼吸特点，自主设计了基于怀特池技术的种子呼吸容器，利用TDLAS构建了高检测限的种子呼吸检测系统。该系统主要包括种子呼吸容器、激光器及其控制模块、恒温箱和数据采集与处理模块。水稻种子呼吸检测系统原理图如图1所示。种子呼吸容器由种子腔和怀特池组成，上层为种子呼吸腔，下层为怀特池。实验中将放有种子的呼吸容器放入恒温箱中保持25 ℃恒温。光源采用nanoplus公司的2 004 nm分布反馈式激光器，其最大正向电流为120 mA，阈值电流为14 mA，工作温度为35 ℃到45 ℃。探测器选用美国GPD铟镓砷InGaAs光电探测器，其响应波长范围可以覆盖2 004 nm附近的CO2吸收谱线。数据采集采用研华PCI-1714L数据采集卡，最大采样速度达30 MHz。信号发生器产生50 Hz锯齿波扫描信号和200 kHz正弦波调制信号，上位机采样速率为10 MHz。

图1 水稻种子呼吸检测系统原理图Fig.1 Schematic diagram of rice seed respiration detection system

实验操作过程如下：(1)接通电源，启动实验设备，打开采集程序；(2)将种子放入呼吸容器中，关闭进出气阀门，盖上盖子保持容器密闭；(3)打开激光器及其控制器，激光器温度设定在一固定值使中心波长定位在CO2气体吸收峰处，并为激光器提供调制信号，激光器发出的光束通过准直器进入种子呼吸容器气体吸收池中，经过多次反射，由光电探测器接收转化为电信号传输至数据采集卡；(4)数据采集后经前置放大板放大后由锁相放大器解调，得到气体吸收光谱的二次谐波信号。经过后续分析处理，反演得到CO2气体浓度值。

1.3 种子处理

有研究表明，种子引发可以提高种子发芽率，促进种子的萌发和出苗[13-14]，所以为了更好测量种子的呼吸作用，通过浸种促进种子呼吸再进行CO2浓度测量。首先将梦两优黄莉占水稻种子分别浸泡0、12、24、36和48 h，利用TDLAS技术对不同浸种时间的种子呼吸释放的CO2浓度进行连续10 h的测量，通过对测量结果分析探寻最佳浸泡时间。再对不同收获期水稻种子按最佳浸泡时间处理，放入种子呼吸容器中进行CO2浓度实时监测，记录数据，然后将种子呼吸数据与发芽试验获得的活力指标进行相关性分析。

以收获期为9月4日的水稻种子为例。试验时将水稻种子从冷藏室取出，在常温下放置12 h后，选择饱满的水稻种子称量5 g进行预处理：(1)消毒处理，配置0.5%次氯酸钠溶液，将清洗干净的水稻种子浸泡在溶液中，进行10 min灭菌处理，取出后用清水冲洗3次。(2)浸泡处理，将消毒之后的种子浸于清水中，浸泡实验所需时长，浸泡温度控制在25 ℃，将达到浸泡时间的种子取出并用吸水纸吸干种子表面水分，放入种子呼吸容器中，并将呼吸容器密封，开启实验设备进行检测。实验记录水稻种子放入呼吸容器后10 h内连续测量的CO2浓度，每组样本重复3次上述实验，将3次测量的结果取平均值，得到CO2呼吸强度变化曲线。

1.4 发芽及田间试验

标准发芽试验：从不同活力水稻种子样品中进行取样，以100粒为重复，试验重复4次，采用纸上发芽，种子之间保持一定距离，保证种子足够的生长空间的同时防止发霉种子间的相互感染。按标准发芽试验的要求进行发芽试验，在20 ℃黑暗下培养16 h，30 ℃光照下培养8 h。第2天开始记录发芽种子数，直至第14天，并测定幼苗长度。发芽率是试验测试种子发芽数所占种子总数的百分比，计算各样品种子活力指标。

淹水3 d发芽试验：将浸种处理后的种子均匀淹没于盛有清水的发芽盒内，淹没3 d，淹水深度3 cm，再采用标准法进行发芽试验14 d。

田间出苗试验：田间出苗验证试验在浙江省湖州市和临安市同时进行，采用0.2%三氯异氰尿酸浸种48 h，均匀播在育秧盘内，以地面幼苗长度达到1 cm为成苗，测量秧苗土面至叶尖长度。

1.5 数据处理

1.5.1 最小二乘法与浓度反演

测量得到的二次谐波信号的峰值是与气体浓度成正比关系的，因此可以直接根据处理后的二次谐波信号幅度，来反演待测气体的浓度。在相同试验参数条件下，将测量系统中的种子呼吸容器分别充入浓度值为1 186、1 376、1 576、1 780和1 976 mg·m-3的CO2气体，根据标准气体测得的二次谐波信号，对测得的待测气体的二次谐波信号进行最小二乘法线性拟合得到拟合系数，根据拟合曲线计算出测量气体的浓度。如图2所示，本系统的CO2浓度值与二次谐波信号函数关系为y=3138.37x+274.71，其中x为二次谐波峰值，y为CO2浓度值。

图2 CO2浓度与二次谐波峰值的线性关系Fig.2 Linear relationship between CO2 concentration and second harmonic peak

1.5.2 数据采集与处理流程

首先获取原始光谱数据，进行累加平均，去除背景信号及较大误差，再进行归一化处理；再设置解调参考信号频率，为扫描锯齿信号频率的二倍，通过正交矢量锁相放大器对信号进行二次谐波检测，提取二次谐波信号；然后采用最小二乘法拟合，利用上述已知浓度气体的标准二次谐波和待测气体所测量二次谐波信号进行对比，得到气体浓度。最后将反演出的CO2气体浓度与种子发芽试验获得的活力指标进行相关性分析，得出实验结论(图3)。

图3 数据采集与处理流程Fig.3 Data collection and processing flow

1.5.3 相关性分析

种子呼吸的生理指标用种子呼吸强度(也叫呼吸速率respiratory rate)来衡量，呼吸强度是指一定时间内单位质量种子放出的二氧化碳量或吸收的氧气量，种子呼吸CO2浓度单位采用mg·m-3。实验数据采用Origin Pro和SPSS26.0软件进行统计和分析。

种子的呼吸强度与活力相关性分析采用相关系数(correlation coefficient)，相关系数计算公式为：

(1)

其中，rxy表示x和y的相关系数，x表示在某时刻种子呼吸产生的CO2浓度，y表示该品种种子经发芽试验得到的活力指标，Sxy表示协方差，Sx表示x的标准差，Sy表示y的标准差。Sxy的计算公式为：

(2)

(3)

(4)

2 结果与分析

2.1 不同浸种和测定时间水稻种子的呼吸强度

从梦两优黄莉占中选取收获期为9月7日的种子，对其分别浸泡12、24、36、48 h，并与未浸泡的种子进行对比试验。种子在呼吸容器中处于密闭状态，通过呼吸作用释放的CO2会在容器中逐渐积累，利用TDLAS系统实时记录呼吸容器中CO2浓度变化，绘制出种子呼吸的CO2浓度曲线如图4所示。容器中初始CO2浓度为实验室空气中CO2浓度，在900～1 050 mg·m-3。水稻种子呼吸产生CO2浓度曲线总体均呈现先增加后逐渐平稳状态。

图4 水稻种子在不同浸泡时间下呼吸强度Fig.4 Rice seed respiration intensity under different soaking time

随着浸泡时间的增加，梦两优黄莉占种子呼吸产生的CO2浓度越高，且浸泡36 h与浸泡48 h种子的呼出CO2浓度曲线较为接近，在测量第8小时后，浸泡36 h的CO2浓度高于浸泡48 h。在测量第10小时时，浸泡36 h呼吸产生CO2的浓度达到10 151 mg·m-3(图5)，显著高于其他浸泡时间的CO2浓度，即浸泡36 h的种子呼吸强度最高。呼吸强度最弱的浸泡时间为0 h即未浸泡，其种子呼吸产生CO2的浓度为388 mg·m-3；浸泡一段时间与未浸泡的种子呼吸强度区分明显，说明适当的浸种时间种子呼吸强度明显提高。

图5 不同浸泡时间的种子10 h内呼吸产生的CO2浓度Fig.5 The concentration of CO2 produced by seeds with different soaking times during respiration within 10 hours

2.2 水稻种子活力与其呼吸强度的关系

2.2.1 不同收获期水稻种子呼吸强度

通过对上述不同浸泡时间下种子呼吸强度的研究表明，种子浸泡36 h可以达到最佳的呼吸强度，以此为基础，将不同收获期种子浸泡36 h后，分别测量其呼吸强度，连续测量10 h左右，记录数据并绘制出呼吸强度变化曲线。

测量时，容器中CO2初始浓度在900～1 050 mg·m-3范围内，水稻种子呼吸产生CO2的浓度曲线总体均呈现先增长再缓慢趋于平缓的趋势(图6)。每个收获期水稻种子在开始测量的前3小时内，种子呼吸产生CO2浓度曲线斜率较小，曲线略有交叉，说明种子呼吸产生CO2浓度较低，呼吸作用较弱，种子呼吸强弱较难区分；在第4小时到第8小时之间种子呼吸作用逐渐增强，呼吸速率提高，呼吸产生的CO2快速增长，在此阶段，不同收获期种子逐渐呈现呼吸强弱等级；在第8小时后，呼吸作用逐渐变慢，CO2释放量增长较少，不同收获期种子间的呼吸强度区分明显。不同收获期水稻种子呼吸强度最高为A4，其次A1、A3、A5三个收获期呼吸曲线较为相近且有交叉，最低为A2。在第10小时不同收获期A1、A2、A3、A4、A5种子呼吸产生CO2总浓度分别为12 379、10 151、12 695、14 823、11 207 mg·m-3。结果表明，不同收获期水稻种子间呼吸强度存在明显的强弱等级。

图6 水稻在不同收获期呼吸强度Fig.6 Rice respiration intensity in different harvest periods

2.2.2 水稻种子活力与其呼吸强度的相关性分析

为了进行呼吸强度与活力指标的相关性分析，对选取的梦两优黄莉占各收获期种子进行呼吸检测，同时进行了标准发芽、淹水发芽、田间出苗等试验，分别获得每个样品的发芽率、发芽势、发芽指数、淹水3 d发芽率及田间出苗率等指标，如表1所示。

选取测量过程中第1小时到第10小时呼吸产生CO2的浓度，对不同收获期种子的呼吸强度与活力指标进行相关性分析。观察到在测量第4小时种子呼吸开始呈现强弱等级，梦两优黄莉占(表2)呼吸强度与各活力指标最高可达到0.97、0.96、0.97、0.77及0.65，其平均值按相关性高低可列为发芽率(0.89)/发芽指数(0.89)>发芽势(0.87)>田间出苗率(0.56)>淹水3 d发芽率(0.46)。结果表明，种子呼吸强度与发芽率、发芽势、发芽指数具有显著相关性，与田间出苗率和淹水3 d发芽率指标具有较高的相关性。

3 讨论

3.1 浸泡时间对种子活力的影响

水分是影响种子萌发的重要条件，当种子内自由水含量降低后种子进入休眠或静止状态，当自由水增多时，才有可能使酶活化而起催化作用[15-18]，吸水后的种子生命活动会逐渐增强。若浸种的时间过短种子没有吸足水分，难以满足物质的代谢需求，会导致种子不能正常发芽。浸种的时间过长种子吸水过多，大量的水分阻隔了氧气会导致种子的呼吸受阻，种子萌发滞后，发芽率下降[19-20]。本研究中，经过淹水3 d处理对种子活力影响程度不一致，但大部分种子的发芽率都显著下降，说明种子浸泡过长时间，降低了种子的发芽率。陈娟等[21]对辣椒种子在淹水胁迫下研究同样表明适宜的淹水可以对种子起到预浸作用，过长或过短的淹水时间都不利于种子发芽。结合呼吸强度的强弱对比初步得出最优浸种时间为36 h，这时水稻种子吸收了充足的水分，种子呼吸作用增强。在一定浸泡时间内种子呼吸强度随时间的增加而增强，超过一定时间后，种子呼吸强度下降，这与张丽波等[22]的研究结果较为一致。陈丽等[23]也通过研究不同浸泡时间下的水稻种子发现在一定的温度条件下，可适当延长种子的浸种时间，但不能超过48 h，延长浸种时间种子的发芽率会明显下降。由于浸泡间隔时间为12 h，今后可以进一步降低浸泡间隔时间，系统试验研究并探索验证种子的生理机制。

3.2 种子呼吸强度变化规律

关于梦两优黄莉占不同收获期的种子呼吸强度的研究，通过连续10 h以上的监测，发现在测量开始前3 h种子呼出CO2浓度曲线变化率较小，不同收获期呼吸曲线略有交叉，呼吸强弱等级较难区分。随着测量时间延长，容器中积累的CO2逐渐升高，不同收获期种子呼吸曲线区分明显，呈现出不同等级呼吸强度。种子呼吸产生CO2浓度总体呈现先增长再趋于平缓的趋势。可能的解释是种子开始测量时环境中氧气充足，种子处于正常呼吸状态，由于测量环境密闭，经过一段时间后在密闭空间中氧气被种子呼吸所消耗，空气中CO2浓度较高，对种子呼吸产生了抑制作用，种子呼吸强度减弱，CO2增加量减少。目前，关于种子活力检测试验大多基于种子萌发初始阶段[24-25]，鲜有对浸泡后种子呼吸强度的实时检测。但种子呼吸环境中氧气含量低，产生CO2过多，会抑制呼吸作用，这与潘威等[9]基于氧传感技术测定萌发阶段处于低O2状态下的烟草种子呼吸作用减弱的研究结果较为相似。今后可以将检测样品数量降低，或者增加呼吸检测仪器容量，以及采用抽气等方法，对种子呼吸过程进行连续长时间监测，从而获得种子呼吸的完整变化趋势。通过延长检测时间进一步系统试验研究不同品种、不同环境下种子呼吸变化趋势。

3.3 种子呼吸强度与活力指标相关性

本研究是基于TDLAS技术测量种子呼吸过程中产生CO2的浓度来表征种子呼吸强度。种子呼吸作用是种子吸收空气中的氧气，将体内的有机物转化成二氧化碳和水，同时将储存在有机物中的能量释放出来的过程。高活力种子的呼吸能力强，低活力种子的呼吸能力弱[26-27]。相关性分析表明，种子呼吸强度与发芽率、发芽势、发芽指数、淹水3 d发芽率及田间出苗率均具有正相关性，尤其与标准发芽活力指标相关性较为显著(表2)。进而推断，对于相同品种的水稻种子，呼吸强度与活力指标均具有较高的相关性，并且通过种子呼吸强度可以对发芽率进行预测。张少英等[28]对甜菜种子的研究发现，发芽率、发芽势与呼吸强度呈正相关，这与本研究结果较为一致。种子标准发芽率、呼吸强度与田间出苗率均存在正相关性，比较而言，呼吸强度与田间出苗率相关性更高，可以作为判断种子活力高低的参考依据。实验结果表明，种子呼吸强度与各活力指标均具有较高的相关性，因此种子呼吸强度作为种子活力评价指标具有一定的代表性和准确性。

在大量研究工作中，种子活力与作物产量性状密切相关[29-30]，种子活力快速、无损、准确的检测方法是种子活力检测方法的重要发展方向[31-32]。TDLAS技术具有响应速度快、灵敏度高、分辨率高等特点，采用TDLAS技术对种子呼吸强度进行测量，可以间接进行鉴定种子活力等级，这为目前种子的活力测量研究提供了一个新的技术方法。

4 结论

本文利用自主设计的高精度种子呼吸检测系统，对梦两优黄莉占种子呼吸产生CO2的浓度进行测量，并做标准发芽试验。可知，不同浸泡时间下，种子呼吸产生CO2的浓度具有明显变化，实验中选取的0、12、24、36、48 h五组浸泡时间中，浸泡36 h其呼吸强度达到相对高值；对种子进行连续呼吸监测，其呼出CO2浓度曲线存在先上升后趋于平缓状态；通过将种子的呼吸强度与不同收获期发芽试验数据进行相关性分析，发现种子的呼吸强度和发芽率、发芽势、发芽指数、淹水3 d发芽率及田间出苗率具有较强的相关性，这说明通过测量种子呼吸强度可以间接进行种子活力等级测量。