丛枝菌根真菌对盐胁迫下番茄抗氧化酶活性和光合特性的影响

赵 华，任晴雯，王熙予，李珍妮，唐秀梅，蒋丽慧，刘 鹏，邢承华，*

(1.金华职业技术学院 农学院，浙江 金华 321017； 2.浙江师范大学 植物学实验室，浙江 金华 321004； 3.广西壮族自治区农业科学院 经济作物研究所，广西 南宁 530007)

番茄(SolanumlycopersicumL.)为茄科(Solanaceae)番茄属(Solanum)一年生或多年生草本植物，食用和药用价值均较高，市场潜力向好。近年来，由于设施栽培中不合理施肥灌溉等因素，次生盐渍化问题日趋严峻，导致番茄产生连作障碍。丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)作为一种专性营养微生物，能够加强植株对干旱、盐碱及重金属毒害等多种逆境胁迫的耐受性，修复退化生态系统[1]。有学者用分室隔网培养法模拟研究接种AMF对玉米(ZeamaysL.)-续断菊(SonchusasperL.Hill)间作体系镉吸收和累积的影响，发现接菌有效增进镉胁迫侧植株对镉的吸收[2]。在抗盐胁迫方面，AMF可通过扩展根系吸收面积、激活抗氧化防御系统、活化矿质营养等多种途径，增强植物对盐逆境的适应性，但是现有的相关研究主要涉及水稻(OryzasativaL.)、玉米、芹菜(ApiumgraveolensL.)等植物[3-5]，对番茄的相关报道鲜少。

AMF具有较好的促生作用，Zhang等[6]从转录水平上得出，接种根内孢囊霉(Rhiaophagusintraradices， R.i)有助于芦笋(AsparagusofficinalisL.)细胞内环境的改善及对氮元素的吸收，激发对盐环境的抗性。但是不同AMF对宿主的亲和力存在差异，Zou等[7]在评估5种AMF 对枸橘[Poncirustrifoliata(L.) Raf.]盐胁迫的缓解效果后，证实了其均有改善植株根系结构、提升生物量的作用，发现地表多样孢囊霉(Diversisporaversiformis， D.v)的促生效益最佳。目前，针对AMF的研究多停留在单一AMF作用后植株的基本性状变化规律，少见对比盐胁迫下各AMF的作用效果以筛选得到番茄高效AMF的相关报道。本研究从4种AMF中初筛得到两种优势AMF，采用盆栽接种试验，测定盐胁迫下AMF处理后番茄各周期的抗氧化物酶活性、叶绿素荧光参数、光合参数、地上及地下部氮磷含量等生理指标，并评估番茄盐害指数，旨在确立番茄高效AMF，从而为最优番茄-AMF共生耦合体系的构建及盐渍土的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试番茄品种为中蔬4号。供试菌株：选取来自于长江大学园艺园林学院根系生物学研究所的幼套近明球囊霉(Clariodeoglousetunicatum， C.e)、地表多样孢囊霉(D.v)、根内孢囊霉(R.i)、摩西斗管囊霉(Funneliformismosseas， F.m)。供试土壤：土壤与河砂1∶1混合过筛，其理化性状为pH值6.2，有效氮45.6 mg·kg-1，有效磷9.32 mg·kg-1，有效钾56.3 mg·kg-1，高压蒸汽灭菌锅内灭菌2 h备用，之后用于优势AMF的筛选及番茄的盐胁迫处理。

1.2 试验处理

试验于2019年6月至2020年5月进行，其中优势AMF筛选在金华职业技术学院实验室完成，番茄盆栽盐胁迫试验在浙江师范大学进行。将番茄种子以无菌水催芽后，栽种于装有等量红壤与河沙混合的塑料花盆中(6粒·盆-1)，并每盆接种50 g菌剂。待长至两叶一心时，每盆选留长势为4～5 cm的番茄苗3株，进行不同浓度盐处理。分别对应6个组别：(1)CK 0组，无菌水和0 mmol·L-1NaCl处理；(2)D.v 0组，D.v菌种和0 mmol·L-1NaCl处理；(3)C.e 0组，C.e菌种和0 mmol·L-1NaCl处理；(4)CK 100组，无菌水和100 mmol·L-1NaCl处理；(5)D.v 100组，D.v菌种和100 mmol·L-1NaCl处理；(6)C.e 100组，C.e菌种和100 mmol·L-1NaCl处理。每个处理组设3个重复，试验在28 ℃和16 h光照的温室中进行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 优势菌种筛选

在预实验的基础上，以AMF在不同盐浓度条件下菌根侵染率和侵染密度为依据筛选优势菌种。采用曲利苯蓝染色法[8]测定菌根侵染率。洗净番茄根系，剪成长约1 cm根段，置于FAA溶液中(70%酒精∶甲醛∶冰醋酸体积比为90∶5∶5)固定24 h，制片镜检。随机取15条l～2 cm长的根在显微镜下进行观察，记录侵染情况，用菌根侵染程序计算侵染率和侵染密度。

1.3.2 盐害指数测定

盐害分级的统计参照杨凤军等[9]方法，在盐处理结束后第3天测定。0级，植株生长正常，无受害症状；1级，植株生长基本正常，个别植株下部少数叶片褪绿；2级，植株生长减缓，个别叶片黄化或枯萎；3级，植株半数叶片褪绿、黄化，3～4片绿叶；4级，植株生长非常缓慢，只有1～2片绿叶；5级，植株严重受害，停止生长，叶片完全黄化。盐害指数 (%)=[Σ (N级×N级株数) /(5级×总株数)]×100。

1.3.3 丙二醛含量测定

接种后第15、30、45天，各组采集等量叶片，将样品放入液氮中保存，采用硫代巴比妥酸法[10]测定叶片的丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量。

1.3.4 游离脯氨酸的测定

接种后第15、30、45天，各组采集等量叶片，将样品放入液氮中保存，采用茚三酮显色法[11]测定游离脯氨酸(proline， Pro)含量。

1.3.5 叶绿素荧光参数含量测定

接种后第15、30、45天，各组采集等量叶片，将活体叶片进行30 min以上暗处理，用便携式叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数[12]。

1.3.6 叶片光合参数的测定

接种后第15、30、45天，各组采集等量叶片，选择自上而下第3个成熟叶片作为测定对象，用便携式光合仪测定叶片光合参数[13]。

1.3.7 抗氧化性酶活性测定

接种后第15、30、45天，各组采集等量叶片，将样品放入液氮中保存，分别采用愈创木酚法[14]、NBT光化还原法[15]、Na2S2O3滴定法[16]测定番茄抗氧化酶SOD、POD、CAT活性。

1.3.8 全氮、全磷含量测定

接种后第45天，收集各组番茄植株，将样品放入烘箱中烘干至恒重，用凯氏定氮仪测定法[17]测定全氮含量，用钒钼酸比色法[18]测定全磷含量。

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 2010整理相关数据、做图，SPSS 21.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析法和Duncan法计算平均值和标准误，分析显著性差异(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同AMF番茄菌根侵染率及侵染密度

菌根侵染率与侵染密度均是衡量共生真菌对植物亲和力的重要指标，能在一定程度上反映AMF的促生效果。从图1可见，无盐处理时D.v组和C.e组均保持较高的菌根侵染率和侵染密度，其中两者的侵染密度与F.m组和R.i组相比均已达到显著差异。盐逆境下各处理组的菌根侵染率和侵染密度均显著下降，R.i组降幅最大，但其余三组差异并不显著。在100 mmol·L-1盐处理后，D.v组两项侵染指标可达28.79%、0.81%，且与R.i相比两者分别增加了1.57倍、6.10倍；C.e组则为27.72%、0.79%。综合考虑不同盐浓度下AMF的侵染效果，可筛选出D.v、C.e为与番茄形成良好共生关系的优势菌种。

C.e，幼套近明球囊霉；D.v，地表多样孢囊霉；R.i，根内孢囊霉；F.m，摩西斗管囊霉。不同小写字母表示不同处理间在P<0.05 水平上差异显著。下同。C.e， Clariodeoglous etunicatum; D.v， Diversispora versiformis; R.i， Rhiaophagus intraradices; F.m， Funneliformis mosseas. Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level among different treatments. The same as below.图1 不同AMF处理下番茄菌根侵染率及侵染密度情况Fig.1 The infection rate and density of tomato mycorrhizal under different AMF treatments

2.2 不同AMF处理下番茄盐害指数情况

由图2可知，盐胁迫组均表现出叶片黄化、萎蔫等盐害症状，未接菌组(CK)植株的盐害指数显著高于接菌组，D.v组最低。其中D.v和C.e组的盐害指数分别为35.63%、51.23%，与C.e相比D.v组的盐害指数降低了30.21%。可见，AMF处理后可以较好地减缓盐离子对番茄的毒害作用，两种菌剂对延缓番茄盐胁迫效应程度不一，D.v缓解效果优于C.e。综上，接种AMF可在一定程度上增强番茄的耐盐能力。

CK，对照(无菌水)。CK， Sterile water.图2 不同AMF处理下番茄盐害指数情况Fig.2 Salt injury indices of tomato under different AMF treatments

2.3 不同AMF对盐胁迫下番茄MDA及脯氨酸含量的影响

从图3可以看出，随时间推移，盐处理后番茄Pro、 MDA含量分别呈下降、上升趋势。经AMF侵染后Pro含量明显减少，其中D.v处理最大降幅达60.66%，C.e仅27.97%；MDA含量增幅也有所减缓，增长速率表现为CK>C.e>D.v。可见，AMF能在一定程度上保护番茄质膜免受活性氧伤害，但两种AMF与盐胁迫下番茄的共生效应存在差异，接种D.v缓解番茄盐害的效果更好。

CK 0，无菌水和0 mmol·L-1盐处理；D.v 0，地表多样孢囊霉和0 mmol·L-1盐处理；C.e 0，幼套近明球囊霉和0 mmol·L-1盐处理；CK 100，无菌水和100 mmol·L-1盐处理；D.v 100，地表多样孢囊霉和100 mmol·L-1盐处理；C.e 100，幼套近明球囊霉和100 mmol·L-1盐处理。下同。CK 0， Sterile water and 0 mmol·L-1 salt stress; D.v 0， Diversispora versiformis strain and 0 mmol·L-1 salt stress; C.e 0， Clariodeoglous etunicatum strain and 0 mmol·L-1 salt stress; CK 100， Sterile water and 100 mmol·L-1 salt stress; D.v 100， Diversispora versiformis strain and 100 mmol·L-1 salt stress; C.e 100， Clariodeoglous etunicatum strain and 100 mmol·L-1 salt stress. The same as below.图3 不同处理组番茄MDA及脯氨酸含量变化情况Fig.3 Changes of MDA and proline content of tomato in different treatment groups

2.4 不同AMF对盐胁迫下番茄叶绿素荧光参数和光合参数的影响

由表1可知，盐处理下番茄叶片Fv/Fm值随胁迫时间延长而下降，Fo值呈逐渐上升趋势，净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)也显著减低。这说明番茄PSⅡ反应中心已受损，盐胁迫引发的光抑制程度升高，气体交换能力受抑。而在D.v、C.e处理后，番茄Fo降幅分别高达18.29%、8.94%，Fv/Fm最高增长率为7.48%、5.58%；Pn、Gs也均有提高，最大增幅分别可达49.12%、35.44%。可见接菌处理能使PSⅡ等光合元件受盐逆境造成的伤害得以减弱，减轻气孔限制并增强光合速率，从而提高共生体对不良环境的适应性。

表1 不同处理组番茄叶绿素荧光参数与光合参数变化情况

2.5 不同AMF对盐胁迫下番茄抗氧化酶活性的影响

由图4可知，随着盐处理时间延长，SOD活性先升后降，POD、CAT活性则呈现一直上升的趋势。未接菌组在处理周期内，抗氧化酶活性无显著变化，而施加2种AMF菌剂后，番茄叶片抗氧化酶活性明显提高。表明，AMF侵染能激活植物抗氧化酶系统，缓解氧化损伤，提高宿主抗盐性。

图4 不同AMF对盐胁迫下番茄SOD、POD、CAT活性的影响Fig.4 Effects of different AMF on SOD， POD and CAT activities of tomato under salt stress

但不同菌种对番茄叶片抗氧化酶活性的影响程度不一，D.v处理下，番茄的SOD、POD和CAT活性均达到最大增长率，分别为37.09%、95.60%、32.71%。由上可知，接种AMF可显著提升番茄对活性氧自由基的清除能力，D.v处理效果更佳。

2.6 不同AMF对盐胁迫下番茄地上、地下部氮磷含量的影响

由图5可以看出，盐处理降低了番茄地上部和地下部的全氮、全磷含量。而接种D.v、C.e处理组番茄的全氮、全磷含量均高于未接菌组CK，得知AMF能够有效抵御盐逆境对植物营养元素吸收造成的侵害。其中D.v的促进作用更为显著，地上部全氮、全磷含量比未接菌组增加18.79%、14.81%，而C.e组则分别为5.49%、8.11%，且地下部趋势与地上部相同。以上结果说明，两种AMF对植物氮磷同化的影响具有一定的差异性，D.v可更好地改善盐逆境下番茄营养元素的吸收和利用。

图5 不同AMF对盐胁迫下番茄地上、地下部全氮和全磷含量的影响Fig.5 Effects of different AMF on total N and P contents in shoots and roots of tomato under salt stress

3 结论与讨论

3.1 优势菌种筛选与氮磷吸收率的变化

丛枝菌根真菌(AMF)是普遍存在于土壤生态系统中的有益共生微生物，其菌丝入侵植物根系皮层细胞后，在细胞间形成菌丝体，并连续分叉形成负责进行菌根真菌和宿主植物之间物质交换的丛枝结构[19]。菌根侵染率反映了菌根形成和共生真菌对植物的亲和力，衡量其生态适应性。结果表明，盐逆境下各处理组的菌根侵染率和侵染密度均有所下降，这可能是因为盐离子会抑制其孢子萌发和初级芽管伸长[20]。各菌剂处理效果存在差异，分析发现D.v组和C.e组仍高于R.i组和F.m组，100 mmol·L-1盐处理后，D.v组侵染率与侵染密度均达到最大增幅，分别为R.i组的1.57倍、6.10倍，这是因为不同AMF与宿主形成的共生体有效性差异较大[21]，D.v、C.e与番茄根系的亲和力较强，更易于与番茄构建共生体系，由此我们筛选出D.v、C.e是对盐环境适应力较强的优质品种。氮磷含量可反映AMF丛枝结构对宿主植物营养吸收的影响[22]。在本试验中，盐处理下番茄氮磷吸收率明显下降，而接菌后均有所提高，且D.v组较C.e组促进作用更为显著，前者全氮、全磷含量分别有最高增长率18.79%、14.81%，后者则分别为5.49%、8.11%。这与Rabie[23]发现AMF可延迟绿豆[Vignaradiata(Linn.) Wilczek]氮的淋失，以及Carreón-Abud等[24]对AMF提高菌根化植株磷含量的探索结论相同，可能是菌丝水解酶分泌与其对植物根系酶系统的活化作用所致。以上可说明AMF可以利用菌丝与其构建的丛枝结构，提高植物对氮、磷的吸收。

3.2 抗氧化系统及光合特性的变化

SOD、POD、CAT是植物细胞内主要的活性氧代谢调节酶，试验中盐胁迫下番茄抗氧化酶系统总体呈上升趋势，接种两种AMF后番茄叶片SOD、POD、CAT活性明显升高，这与Guo等[25]探索盐逆境下AMF对牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)抗氧化酶活性影响所得结论相似。在D.v处理下，番茄的SOD、POD和CAT活性均达到最大增长率，分别为37.09%、95.60%、32.71%，可知D.v定殖更有利于番茄体内免疫相关酶类的合成，增强番茄抗氧化酶防御系统。MDA 是膜脂过氧化的主要终产物，实验结果表明，盐胁迫后番茄MDA含量升高，接种AMF后各处理组的增长速率表现为CK>C.e>D.v，与抗氧化酶活性增速呈拮抗关系，说明AMF能诱导酶促防御系统响应，引起植株体内免疫相关酶类基因表达上调，较大程度地减少MDA积累，减轻氧化损伤，提高宿主抗盐能力。这与邹晖等[26]、吴秀红等[27]实验中内生菌根可提升逆境下植物的相关酶活性来减少MDA含量的结果一致。随处理时间的延长，盐害影响下AMF对番茄体内活性氧清除能力及细胞膜保护效应会有所减弱，这是因为尽管不规则的丛枝根结构能够限制植物对Na+的吸收[28]，但这种限制作用是有限的，胁迫程度过高可能导致菌根中H2O2积累，最终导致丛枝的降解。

脯氨酸是保持原生质体渗透平衡及膜结构完整的调节物质。本研究结果显示，盐处理后番茄体内游离脯氨酸大幅增加，而接种AMF可降低番茄体内脯氨酸含量，与CK组相比D.v、C.e组最大降幅分别为60.66%、27.97%，这与Elhindi等[29]发现AMF可降低甜罗勒(OcimumbasilicumL.)体内Pro含量并缓解盐胁迫的结果相似，说明AMF可提升植物的抗盐应激反应，维持植物体内的渗透平衡，具体可能与AMF改变脯氨酸代谢酶的活性有关。叶绿素荧光参数和叶片光合参数是反映植物光合系统调节状况的重要指标[30]。本研究表明，随着盐胁迫程度的加深，Fv/Fm及Fo均显著下降，接菌延缓了番茄Fv/Fm及Fo的降低，且D.v组较C.e组效果明显。D.v处理后的番茄Fo降幅与Fv/Fm最高增长率分别高达18.29%、7.48%，而C.e则为8.94%、5.58%，说明接种AMF可通过提高PSII对光子的利用和光合电子传递，降低PSII对光抑制的敏感性，从而缓解盐分对寄主植物的不利影响。番茄光合参数与胁迫时间总体呈负相关，其中盐胁迫45 d后D.v、C.e组的净光合速率是CK组的1.49倍、1.08倍，且D.v处理可使气孔导度达到最大增长率35.44%，表明AMF能够通过扩展根系面积，增进吸水能力进而减轻气孔限制[31]，促进光合碳同化的进行，但不同AMF缓解效果各异，D.v对番茄光合作用的促进效果更佳。

AMF对盐害的防治效果存在差异。张淑彬等[32]通过对植株生长效应、全氮、全磷等指标的综合分析，评定结果表明摩西斗管囊霉(F.m)的综合分值高于其他AMF，对沙打旺(AstragalusadsurgensPall.)的综合作用效果最好。本文分析了各接菌处理组对番茄盐胁迫的盐害指数和促生效益等数据，结果显示在各项指数上，D.v与番茄的共生体系对盐胁迫的抵御能力较C.e更好，是建立番茄最优共生体系的高效菌种。然而，AMF对不同植株的作用效果可能存在一定的差异。

综上所述，AMF可有效缓解土壤次生盐渍化对番茄的影响。其主要通过提高植物体抗氧化酶活性、增强光合作用及植株对营养元素的吸收等方式提升番茄对盐逆境的抵抗能力，进而降低盐害指数。笔者从4种AMF中筛选出D.v为最佳促生菌种，可将其应用于番茄-AMF共生耦合体系的建立，以提高番茄的产量和品质，同时为设施农业的可持续发展奠定基础。