意大利蜜蜂amLDH基因的克隆与表达分析

欧阳霞辉， 郑天宇， 徐文凯， 郑相相

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是糖酵解途径中的关键酶之一[1]，普遍分布于动物组织和各种微生物体内，可借助辅酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的氧化型或还原型(NAD+或NADH)参与糖酵解中丙酮酸和乳酸的相互转化[2]。在含氧丰富的组织中可将乳酸氧化为葡萄糖，从而为三羧酸循环提供充足原料；在缺氧状态下可将丙酮酸转化为乳酸，从而保障碳代谢平衡[3-5]。LDH基因编码的同工酶的生化特性多样化，在不同的组织类型和发育状态下，其表达水平差异显著[6-7]。

自Abu-Shumays等[6]提出LDH活性随类固醇激素(20-羟基蜕皮酮)的作用而增加以来，出现了许多其他物种LDH基因被成功克隆并进行深入研究的报道[8]，如人[9]、鼠兔[10]、大鼠[11]、白绒山羊[12]和牦牛[13]等。Makler等[14]研究表明，寄生虫血症和寄生虫LDH活性之间存在相关性。魏琳娜等[15]研究表明，乳酸脱氢酶在肝组织中的表达可催化无氧糖酵解为机体生命活动提供至少24%的ATP，从而增强对低氧环境的适应。湛润生等[16]对山西黑猪不同器官组织LDH同工酶的研究证明不同器官组织中LDH酶活性、种类和相对含量都存在显著差异。黄兴等[17]克隆了类乌齐牦牛乳酸脱氢酶基因，且其在牦牛肺脏中高表达，与牦牛的抗缺氧性状有关。LDH在果蝇胚胎发育的能量代谢中发挥着重要作用[18]，且有研究表明LDH的表达与细胞周期相关[12]，而在蜜蜂等昆虫中还鲜有报道。

本研究以经济昆虫意大利蜜蜂(Apismellifera)为研究对象，克隆了amLDH基因，采用生物信息学方法对amLDH基因及其编码蛋白进行序列特征分析，并通过荧光实时定量PCR技术对意大利蜜蜂不同级型、不同发育阶段amLDH基因的表达模式进行了检测分析，以期为进一步研究该基因在蜜蜂能量代谢中的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

意大利蜜蜂采自甘肃省兰州市五泉王氏养蜂厂，不同级型、不同发育阶段各取30只置冻存管中于-80 ℃保存，所取蜜蜂具体情况如下：工蜂选取卵期2～3日龄(G-2、G-3)；幼虫期5～11日龄(G-5、G-7、G-9、G-11)；预蛹(G-Y)；白眼蛹(G-B)；红眼蛹(G-H)；成虫(G-C)。雄蜂选取卵期2～3日龄(X-2、X-3)；幼虫期4～12日龄(X-4、X-6、X-8、X-10、X-12)；预蛹(X-Y)；白眼蛹(X-B)；红眼蛹(X-H)；成虫(X-C)。蜂王选取卵期2～3日龄(W-2、W-3)；幼虫期4～7日龄(W-4、W-5、W-6、W-7)；预蛹(W-Y)；白眼蛹(W-B)；红眼蛹(W-H)；蜂王成虫(W-C)。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 提取及cDNA的合成

以Trizol法提取意大利蜜蜂总RNA，并以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA。按照宝生物公司PrimeScriptRT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒操作说明书合成cDNA，产物置于-20 ℃保存。

1.2.2 引物设计与合成

参照GenBank中已公布的LDH同源序列(登录号：XM_394662.7)，利用Primer 6.0软件设计引物，预计扩增长度为1 170 bp。根据所得amLDH基因序列及GenBank中已公布的意大利蜜蜂β-actin基因序列(登录号：NM_001185146.1)，利用Primer 6.0软件设计实时荧光定量PCR引物。引物均由上海生工生物股份有限公司合成，序列见表1。

表1 本研究所用引物信息

1.2.3amLDH基因的PCR扩增

以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为10 μL：EXTaq酶5 μL、模板0.5 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、ddH2O 4.1 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4amLDH基因的克隆和鉴定

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，以胶回收试剂盒回收目的片段，将纯化回收后的目的片段与pMD18-T载体连接，转化至大肠埃希菌DH5-α感受态细胞，并涂布在含有Amp+、X-gal、IPTG的LB固体培养基上过夜培养。在培养板上挑取阳性克隆菌落进行扩繁，过夜培养，经菌液PCR阳性鉴定后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.5 生物信息学分析

amLDH基因序列在NCBI中经BLAST序列比对，并使用ORF Finder进行开放性阅读框分析和氨基酸序列推导；利用DNASTAR以及MEGA 6.0进行同源性分析并以NJ法构建进化树；使用ProtParam在线程序预测意大利蜜蜂amLDH蛋白的理化性质；采用Motif Scan在线程序预测翻译后修饰位点；通过InterPro预测amLDH功能域特征；利用PredictProtein在线预测蛋白质二级结构；采用SWISS MODEL、Rasmol、TMpred在线预测并分析蛋白质三级结构。

1.2.6amLDH基因的表达分析

以意大利蜜蜂β-actin为内参基因[19]，使用伯乐荧光定量PCR仪进行RT-qPCR检测。反应体系(20 μL)：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL，反应程序为：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性10 s，63 ℃退火30 s，40次循环。每个样品3个平行重复，采用2-△△Ct法进行基因相对表达量计算，并应用SPSS 21进行单因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及序列分析

PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，结果表明，引物特异性较好，且与预期扩增长度大小符合。经序列比对分析，确定是意大利蜜蜂LDH基因序列，并命名为amLDH，将序列提交至GenBank，登录号为：MK714931。利用NCBI的ORF Finder分析后发现，该序列包含一个1 008 bp的开放阅读框，编码335个氨基酸。

M，DL2000 DNA marker；1，以水为模板的阴性对照；2，amLDH基因PCR产物。M， DL2000 DNA marker; 1， A negative control with water as the template; 2， PCR products of amLDH gene.图1 意大利蜜蜂amLDH基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of amLDH gene in Apis mellifera

2.2 同源性分析及系统进化树构建

采用DNA star软件将该基因氨基酸序列与7种昆虫的氨基酸序列进行同源性分析，发现其与小蜜蜂(XM012485371.1)、中华蜜蜂(XM017059821.1)、大蜜蜂(XM006615361.1)、欧洲熊蜂(XM003396722.3)、家蚕(EU000385.1)、异色瓢虫(HM362898.1)、马铃薯甲虫(KX147667.1)的序列相似度分别为66.6%、96.4%、67.5%、83.5%、72.9%、70.1%、70.0%。进一步使用MEGA6.0软件以NJ法自举检验1 000次构建系统进化树，结果表明(图2)，amLDH在分子进化上与中华蜜蜂关系最近，与其他4类膜翅目蜜蜂聚为一支，与鞘翅目昆虫异色瓢虫和马铃薯甲虫的进化关系最远，这与实际的昆虫进化历程是相符的，说明该基因在进化过程中非常保守，采用其构建的进化树能够反映物种的系统发育关系。

图2 采用NJ法构建的amLDH基因系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of amLDH gene based on NJ method

2.3 amLDH的理化性质及翻译后修饰位点分析

采用ProtParam预测分析amLDH蛋白的分子量、分子组成及等电点等理化性质，结果显示(表2)：amLDH理论分子量和等电点分别是36 597.19和6.66。氨基酸组成中，亮氨酸(Leu)占比最高，占总氨基酸的11.0%。不稳定指数为29.67，低于域值40，其为稳定蛋白。总亲水性0.005，为疏水性蛋白。

表2 意大利蜜蜂amLDH的理化性质

Motif Scan分析翻译后修饰位点结果显示：amLDH含有3个N-糖基化(ASN)位点、8个酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化位点、5个豆蔻酰化(MYRISTYL)位点、4个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点、1个酪氨酸激酶(TYR)磷酸化位点。

2.4 amLDH的二、三级结构分析

PredictProtein预测分析amLDH二级结构结果显示：α-螺旋(H)9个，占比41.79%；β-折叠(E)12个，占比21.19%；无规则卷曲(L)占37.01%。SWISS-MODEL在线预测amLDH的三级结构(模板：4aj4.1A，序列相似度：61.14%)，再经Rasmal软件处理(图3)。其中绿色部位代表7个底物结合位点，其在二级结构上相距甚远，但在空间结构上彼此靠近。使用TMpred预测蛋白跨膜区以及跨膜方向，结果表明，其存在三个跨膜区，分别为26aa-44aa，得分为1 085，螺旋形式由里向外；132aa-151aa，得分为651，螺旋形式由外向里；251aa-267aa，得分958，螺旋由里向外。

图3 预测的amLDH蛋白三级结构Fig.3 Predicted tertiary structure of amLDH protein

2.5 意大利蜜蜂amLDH基因表达模式分析

amLDH基因在意大利蜜蜂不同级型、不同发育阶段均有表达，且差异显著(P<0.05)。在工蜂发育的各个阶段中(图4-A)，卵前期和蛹期该基因表达量较低，卵期3日龄其表达量最高，卵期和从蛹期到成虫期其表达量显著升高。在雄蜂发育的各个阶段中(图4-B)，幼虫期8、10日龄和成虫期该基因表达量较低，卵期3日龄其表达量最高，从幼虫期10日龄到预蛹期其表达量显著升高，从卵期3日龄到幼虫期10日龄以及从预蛹期到成虫期其表达量呈下降趋势。在蜂王发育的各个阶段中(图4-C)，卵前期、幼虫期7日龄、蛹期和成虫期该基因表达量较低，幼虫期4日龄其表达量最高，从卵期2日龄到幼虫期4日龄其表达量显著升高，且在随后的各个发育阶段中其表达量整体降低。

柱状图上同个系列无相同小写字母表示经单因素方差分析各个时期组间差异显著(P<0.05，Duncan氏多重比较法)。The bars without the same lower case letters in the same series showed significant differences among groups in different periods by one-way ANOVA (P<0.05， Duncan’s Multiple Comparison).图4 amLDH基因在意大利蜜蜂工蜂、雄蜂、蜂王中的表达Fig.4 The expression of amLDH gene in Apis mellifera worker bees， drones and queen bees

通过折线图对不同级型、不同时期该基因表达情况进行对比分析结果表明(图5)，蜂王从卵期到幼虫期第一日(卵的孵化阶段)该基因表达量具有较工蜂和雄蜂更大的升高趋势，且蜂王幼虫期该基因基因表达量都显著高于工蜂和雄蜂。此外，蜂王蛹期该基因具有较工蜂和雄蜂更高的表达量，雄蜂次之，工蜂较前两者最低。

L，卵期；F，孵化期；YD，幼虫第一日；YZ，幼虫最后一日；Y，预蛹；B，白眼蛹；H，红眼蛹；C，成虫。L， Egg stage; F， Hatching period; YD， First day of larval; YZ， Last day of larva; Y， Prepupa; B， White-eyed pupa; H， Red-eyed pupa; C， Adult.图5 amLDH基因在不同级型、不同发育阶段的意大利蜜蜂中的表达情况Fig.5 The expression of amLDH gene in different castes and different development stages of Apis mellifera

3 讨论

LDH是一种极为重要的糖酵解酶，与能量代谢、细胞周期和细胞增殖等密切相关，且在肿瘤细胞中LDH酶促反应产生氧化态的辅酶Ⅰ可维持癌细胞的氧化还原平衡[20-21]。在人、鼠兔、大鼠、白绒山羊和牦牛等物种中关于该基因的研究已有不少报道，而在蜜蜂等昆虫中还鲜见报道，鉴于LDH在糖酵解中的重要作用以及生物学效应，在意大利蜜蜂中对该基因的研究十分必要。

本研究克隆得到了意大利蜜蜂amLDH基因，其中包含一个长为1 008 bp的开放性阅读框，共编码335个氨基酸，其氨基酸序列与中华蜜蜂和大蜜蜂的同源关系最近，同源性可在一定程度上反映基因序列的保守性，说明amLDH基因在进化过程中具备较高的保守性。半衰期越长蛋白结构则越稳定，不稳定指数小于40归为稳定蛋白[22]，且α-螺旋和β-转角化学键键能较高，不易扭曲变形，能够维持蛋白的高级结构[23]，意大利蜜蜂amLDH半衰期为30 h，不稳定指数小于40，且总亲水性为0.005，同时α-螺旋和β-转角总占比达62.98%，说明amLDH为稳定的疏水性蛋白。已有研究证实蛋白磷酸化是生物体内普遍存在的信息转导方式[24]，调控着包括细胞的增殖发育和新陈代谢等几乎整个生命活动过程[25]，意大利蜜蜂amLDH基因存在13个磷酸化位点，表明其在意大利蜜蜂的信号转导过程中可能发挥着重要作用。

amLDH基因在意大利蜜蜂不同级型、不同发育阶段均有表达(P<0.05)，表明其可能在意大利蜜蜂的生长发育过程中发挥着重要作用。蜜蜂幼虫3～5日龄是级型分化的关键时期[26-27]，蜂王幼虫初期amLDH基因表达量显著高于工蜂，说明该基因与蜜蜂的级型分化相关。工蜂幼虫孵化后，前三天取食蜂王浆，之后改食蜜粉混合物，在工蜂幼虫发育前期该基因表达量急剧上升并达到最高，工蜂幼虫基因表达量变化规律与发育情况相吻合，推测该基因可能与幼虫的生长发育相关。

不同级型由卵孵化至幼虫阶段该基因表达量均呈上升趋势，可能由于卵的孵化阶段细胞活力增强，从而需要消耗更多的ATP及其他生物大分子(如氨基酸)，该基因参与糖酵解过程为机体生长发育提供大量能量，同时加速三羧酸循环以稳定碳代谢平衡。蜂王整个发育过程历时天数最少，显然是为了满足机体迅速发育的需求，因此在卵的孵化过程中该基因表达量上升趋势较工蜂、雄蜂更为显著，这与卢宜娟等[28]研究意大利蜜蜂蜂王幼虫代谢率变化具有相似的规律，而在工蜂卵的孵化过程中该基因表达量上升趋势较蜂王不显著，可能由于工蜂幼虫的代谢变化低于蜂王所致，同时符合工蜂的生长发育特点[29]。

在变态发育过程中蛹期的生殖器官及其他器官需要进行高度的发育和分化，蜂王蛹期该基因具有较雄蜂和工蜂更高的表达量，雄蜂次之，工蜂较前两者最低。工蜂属于雌性，但生殖器官不发育，工蜂蛹期该基因表达量较雄蜂和蜂王最低，与预期相符。精子新陈代谢的主要能量途径是糖酵解[30]，敲除LDH基因会导致精子中ATP数量减少，且精子活力和质量都显著下降[31-32]，雄蜂蛹期amLDH基因表达量较蜂王次之，推测其在雄蜂精子增殖及运动过程中发挥着重要作用。卵丘细胞中通过糖酵解产生的丙酮酸调控能量供给抑制卵母细胞老化并提供所需的能量[33]，蜂王蛹期amLDH基因表达量最高，推测其在卵巢等器官的发育过程中具有重要作用。

本研究系统地预测分析了amLDH蛋白的理化性质及生物学功能，同时检测并分析了该基因在意大利蜜蜂不同级型、不同发育阶段的表达情况，以期为进一步阐明LDH在意大利蜜蜂生长与发育过程中的功能奠定基础，为对糖酵解的深入研究提供理论依据。