维生素A对大豆7S球蛋白致仔猪肠上皮细胞屏障功能损伤的影响

杨 菊， 邓俊良， 夏江英， 宋天浩， 庞莲凤， 任志华

(四川农业大学 动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室/环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室，四川 成都 611130)

仔猪早期断奶是提高母猪繁殖效益的重要技术手段，但断奶后腹泻导致的仔猪体重流失、生长性能降低给养猪业造成了巨大损失。有研究指出，大豆抗原蛋白导致的断奶仔猪肠道损伤是仔猪断奶后腹泻的根本原因[1-2]，大豆抗原蛋白的热稳定性较强且具有一定的抗消化性[3]，难以通过膨化、酶解等方式被完全去除[4]。大豆7S球蛋白约占大豆总可溶性蛋白的1/3，其主要由β-伴大豆球蛋白、γ-伴大豆球蛋白和碱性7S球蛋白组成，是大豆中的主要抗原蛋白，会引起断奶仔猪等幼龄动物免疫功能紊乱和肠道损伤[5-6]，进而影响其生长性能。大豆7S球蛋白引起的肠道损伤主要表现为肠黏膜形态损伤和屏障功能损伤，且大豆7S球蛋白与断奶仔猪空肠中后段的结合能力最强[7]。本研究的对象IPEC-J2是首次于1989年从新生仔猪空肠中段分离出的非转化柱状上皮细胞系[8]，是用于体外研究猪肠道相关性疾病/营养代谢的主要对象。

维生素A(vitamin A，VA)是动物机体所必需的脂溶性维生素，对多种上皮细胞的生长分化具有调节作用；同时，还能发挥抗氧化和免疫调节作用，是维持黏膜上皮屏障完整性的重要因子[9]。机体(尤其是儿童)VA状态与腹泻类疾病的发生有密切关系，补充一定剂量的VA对腹泻类疾病具有预防和辅助治疗的效果[10]。研究已证实，VA对脂多糖(LPS)诱导的肠上皮细胞损伤具有保护作用[11]。

本研究以IPEC-J2为研究对象，以大豆7S球蛋白作为诱导因素，从细胞活力、细胞跨膜电阻(trans-epithelial electrical resistance，TEER)、荧光素钠渗透性、细胞膜完整性与紧密连接蛋白基因表达几个方面探究VA对大豆7S球蛋白致IPEC-J2细胞屏障功能损伤的影响，为VA能否用于防治断奶仔猪蛋白营养性腹泻提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆7S球蛋白由中国农业大学食品工程学院郭顺堂教授提供(专利号：CN200410029589.4，纯度为86.9%)；IPEC-J2由四川农业大学动物医学院徐志文教授惠赠；VA、荧光素钠购自美国Sigma-Aldrich公司；DMEM F/12培养基购自美国HyClone公司；澳洲胎牛血清、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、二胺氧化酶(DAO)、肠型脂肪酸结合蛋白1(IFABP1)的ELISA检测试剂盒购自江苏酶免实业有限公司；CCK-8试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；24孔Transwell细胞培养板购自美国Corning公司；细胞跨膜电阻仪购自美国Merck Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组

试验共分为9组：对照组(control)、7S(5 mg·mL-17S)、7S+A1(5 mg·mL-17S+0.01 μmol·L-1VA)、7S+A2(5 mg·mL-17S+0.1 μmol·L-1VA)、7S+A3(5 mg·mL-17S+1 μmol·L-1VA)、7S+A4(5 mg·mL-17S+ 10 μmol·L-1VA)、7S+A5(5 mg·mL-17S+100 μmol·L-1VA)、7S+A6(5 mg·mL-17S+1 000 μmol·L-1VA)、7S+A7(5 mg·mL-17S+10 000 μmol·L-1VA)。除检测细胞活力每组设置6个重复外，其余指标每组设置3个重复。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力

将对数生长期的IPEC-J2以每孔5×103个的密度接种至96孔细胞培养板，待细胞贴壁后按分组分别加入对应浓度的处理物，将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养24 h，向每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于培养箱内孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度(D值)。

1.2.3 细胞跨膜电阻检测

将对数生长期的IPEC-J2以每孔2×104个的密度接种于24孔Transwell培养板(直径6.5 mm，孔径0.4 μm，面积0.33 cm2)上层，第1星期隔天换液，之后每天换液，并于换液之前检测TEER，直至TEER稳定，说明IPEC-J2融合至单层。阻值稳定后，按分组分别加入相应浓度的处理物，继续培养24 h后，进行TEER测定。TEER=(实测值-空白值)×有效膜面积。

1.2.4 荧光素钠渗透率检测

在1.2.3节测完TEER之后，吸去培养液，使用37 ℃预热的D-Hanks缓冲液清洗细胞3次，向Transwell上层加入200 μL含60 μg·L-1荧光素钠的D-Hanks溶液，下层加入700 μL D-Hanks溶液，置于培养箱中孵育1 h，吸取下层溶液检测490 nm波长下的吸光值，根据标准曲线计算荧光素钠浓度，再计算荧光素钠渗透率。荧光素钠渗透率(%)=(下层荧光素钠浓度×700)/(60×200)×100。

1.2.5 细胞膜完整性相关指标含量检测

将对数生长期的IPEC-J2以每孔1×105个的密度接种至6孔细胞培养板，待细胞贴壁后按分组分别加入对应浓度的处理物，继续培养24 h。收集上层细胞培养液离心去沉淀，按照ELISA试剂盒说明书检测ALP、LDH、DAO、IFABP1的含量。

1.2.6荧光定量PCR检测ZO-1、Claudin-1和Occludin基因表达情况

将1.2.5节的下层细胞按照Trizol法进行RNA提取，按照反转录试剂盒操作说明将RNA反转录成cDNA。以5倍稀释的cDNA为模板，检测ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表达量，引物序列见表1。结果按2-ΔΔCt法进行计算。

表1 荧光定量PCR引物

1.3 数据处理

使用SPSS 20.0对试验结果进行单因素方差分析，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。试验结果用平均值±标准差表示，柱状图绘制软件为GraphPad. Prism 8.0。

2 结果与分析

2.1 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2活力的影响

如图1所示，与对照组相比，5 mg·mL-1的7S球蛋白导致IPEC-J2活力极显著降低(P<0.01)。与单独添加7S球蛋白组相比，0.1和1 μmol·L-1VA与7S同时添加组细胞活力极显著(P<0.01)升高，10 000 μmol·L-1VA与7S同时添加组的IPEC-J2活力极显著降低(P<0.01)。

柱形图中无相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P<0.01， data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.图1 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2活力的影响Fig.1 Effect of VA on viability of IPEC-J2 injured by soybean 7S globulin

2.2 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2单层细胞TEER的影响

如图2所示，随着IPEC-J2在Transwell培养板里培养时间的延长，TEER呈逐渐升高的趋势，在第18天后稳定在500 Ω·cm-2以上，说明IPEC-J2融合成单层。

图2 IPEC-J2的细胞跨膜电阻Fig.2 Trans-epithelial electrical resistance of IPEC-J2

如图3所示，与对照组相比，5 mg·mL-17S球蛋白处理使IPEC-J2单层细胞的TEER极显著(P<0.01)降低。0.1～10 μmol·L-1的VA与7S同时添加组的TEER显著(P<0.01)高于7S单独处理组，但10 000 μmol·L-1VA与7S同时添加组的TEER极显著(P<0.01)降低。

图3 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2单层细胞细胞跨膜电阻的作用Fig.3 Effect of VA on trans-epithelial electrical resistance of IPEC-J2 monolayer cells induced by soybean 7S globulin

2.3 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2单层细胞通透性的影响

对荧光素钠渗透率的影响结果如图4，与对照组相比，添加5 mg·mL-17S球蛋白导致IPEC-J2单层细胞对荧光素钠的渗透率极显著(P<0.01)升高。0.01～10 μmol·L-1VA与7S同时添加组的荧光素钠渗透率极显著(P<0.01)低于7S单独处理组；1 000和10 000 μmol·L-1VA与7S同时添加组荧光素钠渗透率极显著(P<0.01)高于7S单独处理组。

图4 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2单层细胞荧光素钠渗透率的影响Fig.4 Effect of VA on permeability of sodium fluorescein of IPEC-J2 monolayer cells induced by soybean 7S globulin

2.4 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2细胞膜完整性的影响

VA对大豆7S球蛋白破坏IPEC-J2细胞膜完整性相关指标的影响见图5。单独添加5 mg·mL-17S球蛋白导致细胞培养液中ALP、LDH、DAO和IFABP1含量极显著(P<0.01)升高。0.01 μmol·L-1VA与7S同时添加组的ALP、LDH和DAO含量与7S单独处理组差异不显著，0.1～10 μmol·L-1VA与7S同时添加组的ALP、LDH和DAO含量均显著(P<0.05或0.01)低于7S单独处理组；0.01～10 μmol·L-1VA与7S同时添加组的IFABP1含量均显著(P<0.05或0.01)低于7S单独处理组；而10 000 μmol·L-1VA与7S同时添加组的ALP、LDH、DAO和IFABP1含量则显著(P<0.05或0.01)高于7S单独处理组。

图5 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2细胞膜完整性的影响Fig.5 Effect of VA on destruction of IPEC-J2 integrity by soybean 7S globulin

2.5 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2紧密连接蛋白基因表达的影响

如图6所示，单独添加5 mg·mL-17S球蛋白导致IPEC-J2紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对表达量极显著(P<0.01)降低。由图6-a可知，0.1～10 μmol·L-1VA与7S同时添加组的ZO-1 mRNA表达量极显著高于7S单独处理组(P<0.01)，而10 000 μmol·L-1VA与7S同时添加组导致ZO-1 mRNA表达量极显著(P<0.01)低于7S单独处理组。由图6-b可知，0.1和1 μmol·L-1VA与7S同时添加组的Claudin-1 mRNA表达量显著(P<0.05)高于7S单独处理组。由图6-c可知，0.1～10 μmol·L-1VA与7S同时添加组的OccludinmRNA表达量显著(P<0.05或0.01)高于7S单独处理组。

图6 大豆7S球蛋白诱导下VA对IPEC-J2紧密连接蛋白基因表达的影响Fig.6 Effect of VA on expression of tight junction protein genes in IPEC-J2 induced by soybean 7S globulin

3 讨论

3.1 大豆7S球蛋白对IPEC-J2细胞屏障功能的损伤作用

作为大豆中的主要致敏蛋白，大豆7S球蛋白主要危害断奶仔猪的肠道健康进而影响其生长性能。体外试验表明，大豆7S球蛋白主要抑制仔猪肠上皮细胞的体外增殖、诱导肠上皮细胞凋亡和自噬进而导致其活性下降，还会破坏肠上皮细胞的完整性，抑制紧密连接蛋白的表达，导致体外肠上皮细胞模型的通透性升高，且7S球蛋白浓度越高，作用时间越长，影响越显著[12-15]。本试验参考彭成璐等[16]的研究，用5 mg·mL-17S球蛋白作为诱导因素处理IPEC-J2 24 h，进行细胞损伤模型的构建。试验结果表明，5 mg·mL-1的7S球蛋白处理24 h使IPEC-J2的细胞活力极显著降低，与前人研究结果一致。

肠黏膜机械屏障主要由肠上皮细胞和细胞间的连接复合物组成，因此，肠上皮细胞的完整性和细胞间连接的状态是影响肠黏膜机械屏障通透性的主要因素。TEER是用于评价上皮屏障通透性和完整性的重要指标，其值越大说明屏障通透性越低。LDH是细胞内酶，ALP是细胞膜的标志性酶，当细胞受到损伤、细胞膜完整性被破坏时会释放，因此，细胞培养液中的LDH和ALP含量(或活性)是普遍用来评价细胞膜完整性的重要指标[17]。而DAO和IFABP1是肠上皮细胞的胞内蛋白，具有很高的组织特异性，只有当肠上皮细胞受损时才会释放到细胞外，其在血液中的含量是临床上用来监测肠黏膜屏障通透性的特异性指标[18]。因此，肠上皮细胞培养液中的ALP、LDH、DAO和IFABP1含量能间接反映细胞膜的完整性。紧密连接复合物是维持肠黏膜机械屏障的重要结构，其中，Claudins是肠黏膜上皮选择性屏障的主要结构蛋白；Occludin是维持肠黏膜上皮细胞间通透性的主要功能蛋白；ZOs与细胞骨架蛋白形成广泛连接，在细胞间连接的形成、结构和功能变化中起重要的作用[19]。贾刚等[12]研究表明，7S球蛋白导致仔猪肠上皮细胞IECs完整性破坏，LDH和ALP的释放增加。Zhao等[13]研究表明，7S球蛋白导致IPEC-J2的ALP释放增加，Occludin和ZO-1的mRNA表达量降低，TEER降低。Peng等[15]也发现，7S球蛋白能通过下调Occludin、ZO-1和Claudin-1的表达破坏IPEC-J2的细胞骨架。以上研究表明，7S球蛋白会通过破坏肠上皮细胞的完整性，以及抑制紧密连接蛋白的表达导致肠上皮细胞屏障通透性升高；本研究中5 mg·mL-17S球蛋白导致IPEC-J2单层细胞TEER极显著降低，荧光素钠渗透率极显著升高，细胞培养液中ALP、LDH、DAO和IFABP1含量极显著升高，ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表达量极显著下调，与前人研究结果相符。

3.2 VA对大豆7S球蛋白致IPEC-J2细胞屏障功能损伤的作用

VA是动物必需的脂溶性维生素，具有调节细胞增殖分化、抗氧化、调节免疫等生物功能。给正常动物机体添加一定水平的VA能够促进肠道发育，使肠隐窝变浅、绒毛增高，但过高水平的VA反而会抑制肠道发育[20]。添加VA会导致体外培养的肠上皮细胞增殖数量减少[21]，但促进了肠上皮细胞的分化[22]。以上研究表明，VA通过抑制肠上皮细胞增殖、增强肠上皮细胞分化来促进肠道生长发育。但当肠道受到损伤时，补充VA能在短时间内极显著促进肠黏膜细胞的增殖[23]。关于VA对体外肠上皮细胞活力损伤发挥保护作用的研究较少。本研究发现，0.01～10 μmol·L-1VA能缓解7S对IPEC-J2活力的损伤，且0.1和1 μmol·L-1VA效果较好。p38/JNK MAKP信号通路介导的细胞凋亡是7S球蛋白损伤IPEC-J2活力的主要因素[16]，VA能通过降低JNK磷酸化水平对糖基化终末产物诱导的角膜上皮细胞损伤发挥保护作用[24]，因此，推测VA也可能通过影响JNK MAKP信号通路对7S损伤IPEC-J2活力发挥保护作用。且本研究发现，10 000 μmol·L-1VA导致IPEC-J2活力进一步降低，说明添加高浓度VA反而会损伤肠上皮细胞。

VA能通过促进肠细胞增殖、抑制凋亡来维持肠黏膜的屏障功能[25]。体内试验证明，给乳糖诱导的腹泻大鼠补充VA，能显著降低血清中DAO和Zonulin蛋白的含量，且显著上调小肠Claudin-1和Occludin的表达[26]，提前补充VA也能缓解LPS导致的小鼠肠道ZO-1、Occludin和Claudin-1表达降低的情况[27]。Baltes等[22]发现，在无血清培养液中添加VA能通过促进Claudin-2的表达，增强Caco2单层细胞屏障的完整性，导致其对甘露醇的通透性降低，TEER升高。Yamada等[28]研究发现，添加VA能促进ZO-1的表达，进而增强诱导性多功能干细胞衍生的肠道类器官的屏障功能。He等[11]发现，补充VA能够缓解LPS下调IPEC-J2的ZO-1、Occludin、Claudin-1表达的作用，从而保护IPEC-J2单层细胞的屏障功能。以上研究表明，补充VA能通过影响紧密连接蛋白的表达对肠上皮细胞的屏障功能发挥增强和保护作用。本试验结果表明，0.1～10 μmol·L-1VA与7S同时添加极显著缓解了7S导致的IPEC-J2单层细胞TEER降低、荧光素钠通透性升高的情况，也极显著降低了细胞培养液中ALP、LDH、DAO和IFABP1的含量，0.1和1 μmol·L-1VA同时显著缓解了7S导致的IPEC-J2中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表达下调。说明一定剂量的VA能影响IPEC-J2完整性和紧密连接蛋白的mRNA表达，从而缓解7S导致的IPEC-J2单层细胞通透性损伤。Jiang等[29]发现，VA缺乏会上调MLCK的表达，进而抑制鱼肠道黏膜中紧密连接复合物的表达，说明VA影响紧密连接蛋白表达的机制可能与MLCK信号通路有关，但还需进一步研究证实。本研究发现10 000 μmol·L-1VA会加重7S球蛋白对IPEC-J2单层细胞通透性的损伤，这可能是由于过量VA导致了脂质过氧化[30]，进而损伤了IPEC-J2的细胞活力。

4 结论

IPEC-J2培养液中同时添加VA与大豆7S球蛋白，0.1～10 μmol·L-1VA能通过保护细胞活力和细胞完整性，影响紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表达对大豆7S球蛋白导致的IPEC-J2细胞屏障功能损伤发挥保护作用，10 000 μmol·L-1VA会加重这种损伤。