TLR9和NF-κB在尖锐湿疣组织中的表达

尹光文, 刘佳音, 闫家笛, 耿朦朦, 张译丹

郑州大学第一附属医院皮肤科，河南 郑州 450052

尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)是由人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染引起的常见性传播疾病(sexually transmitted diseases,STD)，主要表现为外生殖器和肛周增生性良性病变，但有演变为肿瘤和巨大型尖锐湿疣(Buschke-Lowenstein tumor,BLT)的可能。CA具有增生快、传染性强、易于复发的特点，可能与CA组织中存在角质形成细胞的异常增殖和凋亡有关[1]。HPV感染、CA的发病与机体的免疫功能密切相关[2]，但确切机制尚未明了。Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLRs)是一类在固有免疫系统中起关键作用并且参与炎症过程的跨膜蛋白。其中TLR9能够被病毒及细菌DNA激活，启动髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)依赖性信号传导途径，激活核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和子蛋白-1(activator protein-1,AP-1)，释放多种炎症相关因子参与免疫应答[3]。NF-κB调节基因转录，经由多种信号传导通路调控相关信号传导，参与包括细胞生存与凋亡、细胞黏附、细胞增殖、分化和生长等多种病理生理过程[4]。目前相关研究显示，TLRs与NF-κB参与包括病毒感染等多种疾病过程[3]，但关于CA组织中TLR9和NF-κB表达情况以及二者之间的关系尚不清楚。本研究采用免疫组化SP法检测TLR9和NF-κB在CA组织和正常包皮组织中的表达情况及相关性，探讨二者在CA发生和发展中可能存在的意义。

1 资料与方法

1.1 材料来源

实验组50例CA标本均来自2019年9月至2020年9月就诊于郑州大学第一附属医院皮肤性病科门诊的CA患者，其中男30例，女20例；年龄16～58岁，平均(32.64±9.70)岁；病程14～100 d，平均(46.80±19.20)d。纳入标准：①参照中华医学会皮肤性病学分会性病学组制定的《尖锐湿疣诊疗指南(2014)》[5],符合CA诊断；②醋酸白检测阳性；③取材前未行任何局部及系统药物治疗，或者激光、冷冻和光动力等物理治疗手段；④1年内未接受任何免疫抑制剂或增强剂治疗。排除标准：①合并其他系统性疾病；②妊娠期或哺乳期。对照组20例标本均取自该院泌尿外科成年男性包皮环切术后切除的正常包皮组织，组织病理学检查均证实为正常包皮上皮组织。所有标本取材后置于10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，连续做4 μm厚度切片。本研究通过郑州大学基层伦理审查委员会批准(科研快审2016-71)，受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂

鼠抗人TLR9单克隆抗体来自Abcam公司，兔抗人NF-κB p65多克隆抗体、3,3-二氨基联苯胺显色(DAB)试剂盒及过氧化物酶标记的链霉亲和素(SP)试剂盒均来自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化检测TLR9和NF-κB的表达情况 两组标本均在同等条件下进行染色，每个切片染色均设置已知染色阳性的切片为阳性对照，PBS液代替抗体为空白对照，整个过程严格依据试剂盒说明书的操作步骤进行。

1.3.2 结果判定 TLR9主要定位在角质形成细胞的胞质或胞膜，NF-κB主要定位在角质形成细胞的胞质或胞核。SP染色下观察到浅黄色、黄色或棕黄色颗粒视为阳性细胞。评定标准参照相关文献[6]对阳性细胞百分比和染色强度进行半定量分级评分。在光学显微镜下通过高倍视野(400×)随机选择每个组织切片的5个不同区域，并将平均分数作为最终结果。①阳性细胞百分比评分：0分：0～10%；1分：11%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%。②染色强度评分：0分：无染色；1分：淡黄色；2分：黄色；3分：棕黄色。将上述两个分数的乘积作为最终分数，最终得分为0分表示为阴性(-)，1～4分表示为弱阳性(+)，5～8分表示为阳性(++)，9～12分表示为强阳性(+++)。

1.3.3 统计学处理 使用SPSS 25.0统计软件对所有实验获得数据进行统计描述和分析。TLR9与NF-κB的阳性表达率差异比较采用2检验；TLR9与NF-κB的阳性表达强度差异比较采用秩和检验；CA组织中TLR9和NF-κB表达的相关性采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR9在CA组织和正常包皮组织中的表达

50例CA患者标本中，47例(94.00%)TLR9不同程度表达于基底层、棘层细胞及颗粒层，为胞质或胞膜内黄色或棕黄色颗粒，表达强度多为++～+++;20例正常包皮组织中未观察到明显的黄色颗粒，仅弱阳性2例(10.00%)，表达强度多为-～+(图1)。两组TLR9阳性表达率(2=48.00，P<0.05)和阳性表达强度(H=-6.56，P<0.05)差异均统计学意义(表1)。

图1 TLR9、NF-κB在CA、正常包皮组织中的表达(SP染色)

表1 TLR9和NF-κB在CA组及对照组中的表达 (例)

2.2 NF-κB在CA组织和正常包皮组织中的表达

50例CA患者标本中，49例(98.00%)NF-κB不同程度表达于棘层细胞内，为胞质或胞核内黄色或棕黄色颗粒，表达强度多为++～+++;20例正常包皮组织中未观察到明显的黄色颗粒，仅弱阳性4例(20.00%)，表达强度多为-～+(图1)。两组NF-κB阳性表达率(2=47.27，P<0.05)和阳性表达强度(H=-6.56，P<0.05)差异均有统计学意义(表1)。

2.3 CA组织中TLR9和NF-κB表达的相关性分析

在47例TLR9阳性表达的患者中，NF-κB全为阳性。在NF-κB阳性表达的49例患者中，47例TLR9阳性，2例阴性。Spearman等级相关分析结果显示CA组织中TLR9和NF-κB的表达呈正相关(r=0.57，P<0.05)。

3 讨论

TLRs家族能够启动天然免疫反应，并在调节天然免疫反应和获得性免疫反应中起重要作用。TLRs拥有Ⅰ型跨膜蛋白结构，可以识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，如病毒、细菌、真菌、寄生虫等，还可以识别由死亡或损失细胞生成的损伤相关分子模式。不同的TLRs家族成员识别不同的PAMP。TLR9作为TLRs家族的一员，识别细菌、病毒基因组中含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤寡核苷酸(CpG)基序的DNA，在病毒感染后的免疫反应中起重要作用[7]。TLR9通过MyD88依赖性信号传导通路启动下游信号传递，刺激NF-κB和AP-1激活，调节α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、Ⅰ型干扰素(Ⅰ-interferon,Ⅰ-IFN)和IL等多种细胞因子、趋化因子的分泌并最终产生免疫效应[8]。适度免疫反应能够有效保护机体防止微生物入侵，但过度反应则会导致一些疾病产生。近年研究发现，TLR9通过产生慢性炎症反应，促进细胞增殖、血管生成、抑制凋亡、免疫逃逸、侵袭和转移来参与疾病的发生发展[3,9-10]。本实验结果显示，CA患者与正常包皮组织中TLR9阳性表达率及阳性表达强度差异均具有统计学意义，表明CA组织中存在TLR9的过表达。推测CA患者由于免疫功能受损，不能及时清除HPV，造成慢性持续感染，TLR9被持续过度激活，通过促进细胞增殖和血管生成、免疫逃逸、抑制凋亡来参与CA的发生发展。

NF-κB是一种广泛存在的核转录因子，而且也是TLRs介导的信号通路中关键下游信号分子。它通过增加特定细胞基因的表达调控宿主炎症、免疫反应以及细胞生长。NF-κB至少调控27种不同的编码基因、靶基因编码蛋白质和microRNAs(miRNAs)等，编码蛋白包括细胞因子、趋化因子、生长因子、补体、黏附分子、免疫识别受体、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等多种免疫相关因子[11]，具有广泛的生物效应。NF-κB参与免疫细胞的激活，调控细胞周期、细胞分化增殖凋亡、B细胞和T细胞的生长分化，并且拥有精确的正负反馈调控机制[12]。近年发现，NF-κB的异常激活和反馈机制破坏与多种临床疾病相关，包括溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、银屑病关节炎以及多种癌症，如口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌、结直肠癌、乳腺癌和骨髓瘤等[13-14]。本实验结果显示，CA组NF-κB阳性表达率和阳性表达强度均明显高于正常包皮组织，差异具有统计学意义。NF-κB在CA组织中的过表达提示NF-κB受到HPV持续感染后异常激活及反馈机制破坏，促进异常增殖和血管生成、抑制凋亡，产生慢性炎症反应。

本研究显示，CA组织中TLR9和NF-κB存在过表达，且二者存在一定的相关性(r=0.57,P<0.05)，存在协同效应。也有研究显示CA组织中TLR9呈低表达[15]。研究结果的差异一方面可能与研究样本量有关，另一方面推测在HPV感染机体的自然病程中，TLR9激活的不同结果可能取决于HPV对TLR9的抑制强度和宿主免疫应答之间的平衡。如免疫反应在一段时间内不能有效清除HPV感染，TLR9将可能在持续感染的组织中过表达。

综上所述，TLR9和NF-κB在CA组织中均为高表达，二者表达呈正相关，推测二者协同参与CA的发生与发展。但本研究样本量较少，二者在CA发病中的确切作用尚需进一步研究。