脱色素技术在恶性黑素瘤HE染色及免疫组化中的应用条件

王卓, 李海翩, 陈小红

1.广州市妇女儿童医疗中心,广东 广州 510620; 2.中山大学附属第一医院，广东 广州 510080

恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一种起源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤，具有高度侵袭性且极易发生转移，主要累及皮肤及粘膜[1]。恶性黑素瘤确诊时，肿瘤细胞的异型性是确定病变组织良恶性的重要指标，而组织切片中浓密黑色素颗粒的遮挡，会影响病理医生的观察，且对免疫组化染色结果的识别判断带来困难。在临床病理研究中，常对肿瘤标本脱色素处理后再进行免疫组化检测，但脱色素后极易引起切片组织脱落，一直是研究者困扰的问题之一[2]。

本研究选取2例恶性黑素瘤患者的组织切片进行高锰酸钾/草酸脱色素处理[3]，其中每例患者选取20张切片，每种脱色素方法中，取1张切片进行HE染色，4张切片应用免疫组化法检测Stathmin的表达，探讨脱色素技术在恶性黑色素瘤免疫组化研究中的应用条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选自中山大学附属第一医院病理科2例经病理诊断为恶性黑素瘤[1]的存档蜡块，经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋后，切成4 μm厚的连续切片备用。高锰酸钾和草酸为广州化学试剂厂产品；PBS缓冲液及柠檬酸修复液为Boster生物公司产品；苏木素染色液及伊红水溶液为Leagene公司产品；Stathmin为CST公司产品；MaxVisionTM试剂盒及DAB显色液试剂盒为福州迈新公司产品。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常规脱蜡至水，蒸馏水洗；脱色素处理；此后步骤同HE常规操作流程。

1.2.2 免疫组化染色 烤片、脱蜡、水化、抗原修复；脱色素处理；此后步骤同免疫组化常规操作流程。

1.2.3 脱色素处理 设置4种不同高锰酸钾草酸浓度及处理时间：①0.5%高锰酸钾滴片，室温处理10 min，2%草酸浸洗5 min，PBS浸洗5 min×2次；②0.25%高锰酸钾滴片，室温处理10 min，2%草酸浸洗5 min，PBS浸洗5 min×2次；③ 0.25%高锰酸钾滴片，室温处理3 min，2%草酸浸洗3 min，PBS浸洗5 min×2次；④在石蜡切片脱蜡之后进行后固定，即脱色素之前用4%多聚甲醛固定15 min，蒸馏水洗，0.25%高锰酸钾滴片，室温处理3 min，2%草酸浸洗3 min，PBS浸洗5 min×2次。观察不同处理后HE染色及免疫组化染色效果。

2 结果

2.1 HE染色结果

比较4种方法对既往报道过的高锰酸钾及草酸脱色素时所使用的浓度及时间，结果(表1)显示：方法①高锰酸钾浓度0.5%、处理时间为10 min时，组织脱片现象严重，严重影响病理观察及诊断；方法②降低高锰酸钾浓度至0.25%时仍有轻微脱片现象；方法③④降低高锰酸钾浓度至0.25%、处理时间缩短至3 min时可获得较好的脱色效果，方法③偶发轻微脱片情况，方法④在脱色素处理前使用多聚甲醛进行固定，可进一步保证切片的完整性(图1)，无组织脱片现象。

图1 采用方法④对皮肤恶性黑素瘤组织切片进行脱色素处理的前后对比，脱色素前大量黑色素颗粒遮盖了细胞形态,脱色素后细胞形态清晰

表1 不同脱色素方法处理过程及结果

2.2 Stathmin免疫组化染色结果

免疫组化染色切片脱落情况与HE染色结果类似，方法①高锰酸钾浓度为0.5%且处理时间为10 min时组织脱片现象严重，无法判读；方法②中仍有轻微脱片情况，且会引起抗原抗体结合的敏感性下降，导致免疫组化染色呈弱阳性甚至假阴性；方法③能在脱色素的同时尽可能地保证组织切片的完整性以及抗原的敏感性，但仍有偶发轻微脱片现象；方法④几乎无脱片现象，免疫组化结果呈阳性，脱色素效果可(图2)。

图2 三组实验方法下皮肤恶性黑素瘤的免疫组化染色效果：未进行脱色素时，大量黑色素颗粒沉积；方法②染色呈弱阳性;方法④染色效果可

3 讨论

免疫组化染色中适宜的脱色素法应同时具备以下几个条件：脱色素效果较好；细胞形态未发生破坏，组织无丢失或脱落；组织抗原的特异性及敏感性未发生改变。免疫组化过程中，组织内的抗原与特异性抗体结合，DAB显色后大多呈现棕黄色颗粒，但恶性黑素瘤细胞中常含有大量浓重粗大的黑色素颗粒，造成组织结构和细胞形态不清楚，严重干扰HE染色下细胞形态的观察及免疫组化染色情况的判断，从而导致诊断困难。

黑色素由黑色素母细胞的粗面内质网和高尔基体合成，是一种不含铁而含硫的色素，性质非常稳定，完全不溶于水，且不溶于大多数有机溶剂，但可以被高锰酸钾、过氧化物等强氧化剂漂白[4]。脱色原理是打开黑色素的酚环，使黑色素脱色。组织切片脱色素的方法有很多，包括高锰酸钾草酸法、过氧化氢脱色法、氯化钾乙醇盐酸法及溴水脱色法等[5-7]，其中高锰酸钾草酸法及过氧化氢法最常用[8]。McGovern等[9]研究显示高锰酸钾草酸法较过氧化氢法而言具有操作简便、脱色素彻底、不易脱片等特点，故本实验中选用高锰酸钾草酸法进行脱色素处理。

既往传统的高锰酸钾草酸法脱色素费时长,且长时间的浸泡易造成组织脱片，并且改变组织的抗原性[10]。王从阳等[10]发现使用0.25%高锰酸钾处理标本，脱色素效果好且无脱片现象。Kligora等[11]研究发现高锰酸钾浓度在0.125～0.5 g/L时，黑色素颗粒不能完全去除，然而当增加高锰酸钾溶液浓度时，可能会出现细胞形态改变，或出现大量无结构的“影子”细胞，甚至出现组织丢失或脱片。郭以河等[3]发现0.5%高锰酸钾溶液处理5 min联合2%草酸溶液处理2 min后色素基本祛除，HE染色细胞形态清晰，免疫组化表达效果良好。Orchard等[12]发现使用高锰酸钾草酸脱色素法会引起某些抗原的特异性及敏感性发生改变。林兴滔等[13]发现利用0.1%高锰酸钾进行褪黑色素耗时短、脱色素完全，且可保存更多抗原信号；而相同的脱黑色素时间对于不同抗原的影响程度不一致，脱色素时间的延长会影响抗原的表达从而出现假阴性率升高。本实验结合既往研究结果在前期的预实验中发现，使用0.25%高锰酸钾溶液及2%草酸溶液为脱色剂，处理时长控制在3 min时，不仅极少发生脱片现象，同时保证较好的脱色素效果及保证组织的抗原活性不受影响。实验过程中发现当高锰酸钾浓度提高时，脱色素效果虽好，但组织切片脱片的概率也随之升高；当高锰酸钾处理时间过长时，抗原的敏感性下降，造成免疫组化染色结果呈现假阴性。

为进一步探讨脱色素组织的免疫组化效果，本实验将黑素瘤脱色素处理和免疫组化染色结合，发现经高压抗原修复后再脱色素处理，脱色颗粒效果佳，组织不易脱片。在本实验过程中曾尝试在抗原修复之前就进行脱色素，结果发现组织脱片情况严重，无法进行后续的免疫组化染色。出现这一现象的原因推测可能是由于抗原修复这一步骤本身就极易造成组织的破坏和脱落，假如在这之前使用高锰酸钾/草酸进行脱色素处理，组织与玻片间的黏附性受到破坏，在抗原修复时，不断沸腾的高温液体极易引起组织破坏、缺失及脱落。唐洁等[14]认为先进行脱色素而后进行抗原修复出现组织脱片严重的原因是脱色素时强氧化剂作用于切片，破坏了载玻片上涂胶多聚赖氨酸阳离子基团的结构，组织和载玻片黏附性降低。故本实验中，黑素瘤切片标本先进行抗原修复，再用4%多聚甲醛进行后固定，而后使用0.25%高锰酸钾及2%草酸进行脱色素，可得到较好的脱色素效果及免疫组化效果。

本研究结果显示，采用0.25%高锰酸钾溶液及2%草酸溶液进行脱色素处理，时间控制在3 min时，组织的抗原性依然保持良好，未脱色素及脱色素后的抗原表达情况基本一致，是适用于恶性黑素瘤的HE染色及Stathmin免疫组化染色的脱色素方法，值得进行临床参考和推广。但不同的抗原对脱色素时间的把握不同。故建议首次使用的抗原标记进行免疫组化染色需脱色素时，进行预实验探索合适的脱色素浓度及时间。