皮肤黑素瘤中囊泡胺转运蛋白1的免疫浸润景观和预后价值的鉴定

洪梓德, 杨斌

1.南方医科大学第一临床医学院，广东 广州 510515；2.南方医科大学皮肤病医院, 广东 广州 510091

皮肤黑素瘤(skin cutaneous melanoma,SKCM)由黑素细胞恶变转化而来[1]，死亡率约为60%[2]。一般认为，SKCM的预后与肿瘤中溃疡的存在与否、肿瘤浸润深度、有丝分裂率以及受累淋巴结数目密切相关[3]。但这些经典的预后评估方法始终不能令人满意[4]。因此，科学家深入研究了与肿瘤相关的分子标记物，期待通过寻找特异和敏感的生物标志物，使诊断、预后和风险评估更加准确易行。囊泡胺转运蛋白1(vesicle amine transport protein-1,VAT1)属于醌氧化还原酶亚家族[5]。VAT1在胶质母细胞瘤中高表达，并促进胶质母细胞瘤的迁移、增殖和耐药性的产生；高表达的VAT1是胶质母细胞瘤的一个不良预后因素[6-7]。同样，VAT1在胶质瘤患者中的高表达是胶质瘤患者较低生存率的潜在指标，VAT1可能参与胶质瘤诱导的免疫抑制，成为胶质瘤免疫治疗的新靶点[8]。在肝癌中，VAT1的表达水平较高，其表达水平可有效预测肝癌的侵袭和预后[9]。进一步的研究表明，VAT1可以作为一个有希望的新靶点，围绕这个靶点，能够去开发针对肿瘤的迁移抑制剂[10]。在SKCM中，VAT1尚未被评估。因此，本研究采用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)和基因表达汇编(gene expression omnibus, GEO)的相关数据集，评估VAT1在SKCM中的作用。

1 材料与方法

1.1 数据采集

从公开的TCGA下载SKCM患者数据集(包括基因表达谱和临床信息)，共472例肿瘤组织。采用TPM(transcripts per million)方法对RNA测序数据进行归一化处理。从公开的GEO数据库中下载GSE98394(包括基因表达谱和临床信息)，共78例患者组织，排除其中27例痣组织，纳入51例SKCM肿瘤组织，采用和TCGA同样的方法处理数据。

1.2 方法

应用基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)(http://GEPIA.cancer-pku.cn/index.html)数据库[11]分析VAT1的表达情况并绘制生存曲线。

使用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[12]对VAT1在SKCM中的表达及其与免疫浸润的相关性进行系统分析。

将来自TCGA的472个SKCM样本进行基因表达数据归一化，并上传到CIBERSORT(http://cibersort.stanford.edu/)[13]门户网站，算法以1 000个排列的默认矩阵运行,检测22种TIICs在SKCM中的免疫应答。为研究VAT1的表达对免疫微环境的影响，将从CIBERSORT运算后得到的样本分为VAT1低表达组和高表达组，对比两组之间22种TIICs的丰度，以评估VAT1与肿瘤微环境中免疫细胞比例的相关性。

采用人类蛋白图谱(the human protein atlas, HPA)[14]下载VAT1在正常人皮肤和黑素瘤中的免疫组化图像，验证VAT1的表达情况。

1.3 统计分析

采用R-4.0.3对TCGA和GSE98394获得的数据进行合并和统计。采用单因素Cox分析评估VAT1表达及其他临床病理因素(年龄、性别和stage分期)对生存率的影响，对VAT1高表达组和低表达组在GSE98394数据集中的生存时间进行对比分析，制作生存曲线图。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VAT1的表达情况和生存相关性分析

排除129例临床信息数据不足或缺失的病例，共纳入343例SKCM。其中stage 0期6例(1.7%)、Ⅰ期69例(20.1%)、Ⅱ期115例(33.5%)、Ⅲ期143例(41.7%)、Ⅳ期10例(2.9%)。随访时间14～7 563 d,中位数为1 195 d。GEPIA显示的箱线图(图1A)和HPA显示的免疫组化图像(图1B、1C)表明，VAT1在SKCM中的表达明显高于正常组织。GEPIA显示的生存曲线(图2A)提示SKCM中VAT1的表达增加与总生存率相关(P=0.002)，这种相关性在GSE98394数据集(图2B)中得到验证(P=0.004)。使用Cox回归的单变量相关分析显示(表1)，SKCM中stage分期和VAT1的表达水平与总生存率相关。

表1 单因素Cox回归分析TCGA和GSE98394数据的临床病理特征和总生存率的关系

图1 VAT1在SKCM中的表达情况 用GEPIA分析VAT1在SKCM和正常皮肤中的mRNA表达差异(1A)；用HPA分析VAT1在SKCM(1B)和正常皮肤(1C)中的免疫组化图像

图2 来自GEPIA(2A)网站和GSE98394数据集(2B)的VAT1差异表达生存曲线

2.2 VAT1表达与肿瘤浸润性免疫细胞的关系

有分析表明肿瘤浸润淋巴细胞是皮肤黑素瘤患者前哨淋巴结状态和生存率的独立预测因子[15]。本研究将TCGA的472例肿瘤标本按VAT1表达分为高表达组和低表达组，各236例，均符合筛选标准。CIBERSORT探索下载样本的基因表达谱，结果显示了22个免疫细胞亚群的比例(图3)，驻留记忆CD4+T细胞、活化的记忆CD4+T细胞、M1巨噬细胞、驻留肥大细胞、调节性T细胞、活化的NK细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞是VAT1表达影响的主要免疫细胞。其中，驻留肥大细胞(P=0.032)、调节性T细胞(P=0.034)、活化的NK细胞(P=0.014)、嗜酸性粒细胞(P<0.01)在高表达组较低表达组明显增多。与低表达组相比，高表达组的驻留记忆CD4+T细胞(P=0.016)、M1巨噬细胞(P=0.006)、活化的记忆CD4+T细胞(P<0.01)、浆细胞(P=0.012)减少。

图3 SKCM中VAT1的表达水平与22种免疫细胞亚群比例的相关性分析

2.3 SKCM的免疫浸润水平与VAT1表达和SKCM累积存活率有关

使用TIMER分析评估VAT1的表达与免疫浸润水平的关系,结果显示(图4A)，在SKCM中VAT1的表达水平与低免疫浸润相关:在原位皮肤黑素瘤患者中，VAT1表达水平与CD8+T细胞浸润水平呈负相关(r=-0.20，P<0.01)，与中性粒细胞浸润水平呈负相关(r=-0.26，P<0.01);在转移性皮肤黑素瘤患者中，VAT1表达水平与CD8+T细胞(r=-0.16，P<0.01)、巨噬细胞(r=-0.15，P<0.01)、中性粒细胞(r=-0.29，P<0.01)、树突状细胞浸润水平均呈负相关(r=-0.12，P<0.01)。在转移性皮肤黑素瘤中，B细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞和树突状细胞是与SKCM累积存活率相关的因素(图4B)。

图4 6种免疫细胞浸润水平与VAT1表达水平(4A)、SKCM的累积存活(4B)的相关性分析

3 讨论

VAT1是一种细胞溶质可溶性蛋白，能够转移磷脂酰丝氨酸[16]。VAT1也可以在多种癌症组织中表达，包括脑、肝脏、胃等。目前尚无VAT1对SKCM的潜在预后影响报道。因此，本研究对VAT1在SKCM中的免疫浸润和预后价值进行探讨，首次分析VAT1在皮肤黑素瘤患者中的表达。

在临床和RNA-seq数据的背景下，本研究对343例皮肤黑素瘤患者回顾性分析的结果表明，在SKCM患者中，VAT1的表达较正常人高，高表达的VAT1与SKCM的不良预后相关。此外，研究表明，SKCM中不同的免疫标记物集和免疫浸润水平与VAT1表达相关。推测VAT1可能对肿瘤免疫学有潜在的影响。

使用在线数据库GEPIA和单因素Cox分析发现，VAT1表达与SKCM患者生存率存在相关性,并且这种相关性在数据集GSE98394中得到验证，提示VAT1表达上调与预后呈负相关。研究还观察到VAT1在皮肤黑素瘤中过度表达，并通过HPA进一步证实。

本研究表明，在SKCM中VAT1的表达与免疫浸润水平相关。CIBERSORT分析表明VAT1表达与SKCM中驻留记忆CD4+T细胞、M1巨噬细胞、活化的记忆CD4+T细胞和浆细胞呈负相关。同样，不同免疫细胞的基因标记物与VAT1表达的关系也暗示了VAT1在调节SKCM肿瘤免疫微环境中的重要意义。T细胞在肿瘤微环境或周围组织中均表现出抗黑色素瘤的能力[17]，这种抗黑色素瘤作用的能力在清除肿瘤细胞中起着重要作用。T细胞可以通过释放穿孔素和颗粒酶来攻击黑色素瘤细胞，从而导致细胞凋亡和新抗原在肿瘤床上的扩散[18-19]。位于肿瘤龛内的巨噬细胞能够吞噬死亡的黑色素瘤细胞，并将癌抗原呈递给T细胞，以激活基于T细胞的二级适应性免疫反应[20-21]。因此，VAT1对SKCM的不良影响可能与T细胞和巨噬细胞的低密度有关。

综上，本研究结果支持VAT1与SKCM预后和免疫浸润的相关性。无论是在转移性黑素瘤，还是在原位黑素瘤中，VAT1表达水平都与CD8+T细胞和中性粒细胞的浸润水平呈负相关。而在转移性黑素瘤中，VAT1表达水平还与树突状细胞和巨噬细胞的浸润水平呈负相关。研究结果强调了VAT1在SKCM中对巨噬细胞免疫浸润的明显影响。提示VAT1可能是SKCM低存活率的一个预后分子标志物，并与一些免疫细胞的浸润减少相关。因此，建议对VAT1在皮肤黑素瘤中的生物学功能行进一步研究。