UPLC-MS/MS法测定动物源性食品中16种非甾体消炎药残留量

方志娟 李晓芹 丁洪流 何新叶 金萍 王伟

摘要 [目的]建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）定量检测动物源性食品中16种非甾体消炎类兽药残留量的方法。[方法]样品用甲酸-水-乙腈混合溶液提取，净化后经C18色谱柱分离，UPLC-MS/MS法测定。[结果]样品由基质匹配标准曲线进行定量，所检测的16种非甾体消炎药在1～200 ng/g线性关系良好（R2>0.995）。分别添加1倍定量限、2倍定量限和10倍定量限3个水平的混合标准溶液进行回收率试验，各个浓度水平加标回收率在70%～105%，相对标准偏差（RSD）均在15%以下（n=6）。[结论]该方法简便、稳定、准确，具有良好的重现性，适用于测定动物源性食品中16种非甾体消炎类兽药残留量。

关键词 超高效液相色谱-串联质谱法;非甾体消炎类药;动物源性食品;兽药残留

中图分类号 TS 207  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）21-0211-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.054

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of 16 Non-steroidal Anti-inflammatory Veterinary Drugs Residues in Animal-origin Foods by UPLC-MS/MS

FANG Zhi-juan  LI Xiao-qin  DING Hong-liu2 et al

（1.Suzhou Institute for Food Control， Suzhou，Jiangsu 215104;2. Suzhou Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Suzhou，Jiangsu 215104）

Abstract [Objective]To establish a method for the quantitative determination of 16 non-steroidal anti-inflammatory drugs （NSAIDs） in animal-origin foods by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. [Method]The samples were extracted with a mixture of formic acid-water-acetonitrile. After purification， the samples were separated by C18 column and quantitatively detected by UPLC-MS/MS. [Result]The samples were quantified by matrix matching standard curves. The 16 NSAIDs had good linear relationships in the range of 10-200 ng/mL （R2 >0.995）. The mixed standard solutions of   2 and 10 times of the limits of quantification （LOQ） were added respectively for the recovery experiments，the recovery rates of each concentration level were 70%-105%， and the relative standard deviation （RSD） were all less than 15%（n=6）. [Conclusion]The method is simple， stable， accurate and reproducible. It is suitable for the determination of 16 NSAIDs in animal-origin foods.

Key words Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; Non-steroidal anti-inflammatory drugs （NSAIDs）;Animal-origin foods;Veterinary drug residue

基金項目 苏州市科技计划项目（SS2019039，SS202038）。

作者简介 方志娟（1987—），女，江苏南通人，工程师，硕士，从事食品检测与质量管理工作。*通信作者，工程师，硕士，从事食品安全检测与分析工作。

收稿日期 2021-06-23

近年来，兽药在养殖和畜牧业中使用的越来越广泛。动物源性食品中的兽药残留一方面会限制养殖和畜牧业的健康发展，另一方面，随着动物体内兽药的积累和对外排泄量的增多，会对生态环境造成严重影响，进一步还会对人类食品安全以及身体健康造成威胁[1]。非甾体类消炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）具有抗炎、退热、止痛、抗风湿、抗凝效果[2]，临床上主要用于风湿性疾病、心血管疾病、肿瘤类疾病和慢性疼痛等。每天全球约有3 000万人使用，每年的处方量达5亿，消耗量仅次于抗生素[3-4]。在兽药领域主要用于猪、牛、羊等动物感染性疾病引起的发热及急性炎症反应，其在动物源性食品中的过量残留会导致食用者发生高血压、心肌梗死、心力衰竭和心律失常等疾病[5-6]。

由于频繁大量的使用、人与动物的排泄、污水处理技术的局限性以及废弃药物的不合理处置等因素，未被完全吸收和利用的NSAIDs及其代谢物以多种途径最终进入水环境，在地表水环境中频频检出。环境污染带来的危害不容小觑，虽然其在水环境中的残留浓度很低只有微量级别，但是因其有源源不断的输入源头，导致其会给水环境中非靶向水产品带来潜在环境风险，甚至通过食物链和食物网影响人类健康。许多国家和地区规定了非甾体类药物的最大残留量。Izadi等[7]提出NSAIDs作为环境中被识别的新兴污染物，引发了环境研究人员的关注，需要对其检测技术方面进行广泛的研究。Marmon等[8]对NSAIDs混合物在环境中对鱼类构成的风险进行药理学信息预测，认为长期接触这些化合物可能会对鱼类种群造成不可忽视的影响。NSAIDs在我国还未引起重视，现有关于NSAIDs的研究文献多集中在临床和环境领域，作为常用兽药和水体中的污染物，水产品中NSAIDs相关的暴露研究很少。食用农产品的抽检未见到NSAIDs药物，相关的限量指标也不全面[9]，缺少相关动物源性食品中NSAIDs问题率的数据，为食品安全监管埋下了隐患，亟待建立有效的动物源性食品中NSAIDs的检测方法。

液相色谱串联质谱技术结合了色谱和质谱的优点，将色谱的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度完美结合，是近些年来水、土、动物源性食品等基质中多类兽药残留快速测定的首选方法[10-17]。该研究建立同时检测动物源性食品中氟灭酸、茚酮苯丙酸、双水杨酸酯、卡洛芬、酮基布洛芬、托灭酸、美洛昔康、氟尼辛、甲灭酸、双氯芬酸、吡罗昔康、萘丁美酮、舒林酸、托麦汀、吲哚美辛、替诺昔康16种NSAIDs的高效液相色谱-串联质谱方法，对前处理过程中样品提取溶剂中乙腈和甲酸比例进行优化，并考察净化后的基质效应，确定基质加标法消除基质效应对定量结果的影响，以期为健全食品检验检测体系、强化食品安全监管、保障人民群众舌尖上的安全提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（质谱级，德国默克公司）;甲酸（色谱纯，美国TEDIA天地公司）;乙腈（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;试验中水为实验室自制一级水。16种非甾体消炎药混标（天津阿尔塔科技有限公司）。Cleanert LipoNo 15 mL萃取管（博纳艾杰尔科技公司）。猪肉和鸡蛋等样品为苏州农贸市场上随机购买。

1.2 仪器与设备

Waters UPLC I-Class QTRAP 6500+超高效液相色谱-线性离子阱-三重四级杆质谱仪，配电喷雾离子源（美国AB SCIEX公司）;RiOsTM超纯水仪（美国密理博公司）;N-EVAP氮吹仪（美国Organomation公司）;数显型涡旋混合仪（德国IKA公司）;Allegra X-30R高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制。

准确移取100 μg/mL混合标准溶液1 mL，用甲醇定容至10 mL，配制成10 μg/mL混合标准储备液，存储于棕色储液瓶中，在-18 ℃保存。移取适量混合标准储备液，用甲醇定容，配制成100 ng/mL的混合标准工作溶液，现配现用。

1.3.2 样品前处理。

准确称取均质后的试样2 g（精确至0.01 g），至50 mL带盖塑料离心管中，加入10 mL 0.5%甲酸-90%乙腈混合溶液，涡旋混匀1 min，超声2 min。在8 000 r/min的转速下离心3 min后，取3 mL上清液加入萃取管振摇1 min，在10 000 r/min的转速下离心5 min。取上清液2 mL，氮吹至近干，用初始流动相定容至0.5 mL后，供UPLC-MS/MS分析。需同时进行空白试验。

1.3.3 基质加标标准工作曲线。

称取与试样基质相应的阴性样品（精确至0.01 g），加入适量的混合标准工作溶液，按照“1.3.2”方法，与试样一起进行提取和净化。

1.3.4 色谱条件。

色谱柱为Kinetex F5 1.7 μm 100 ，100 mm×2.1 mm;柱温40 ℃，进样体积5 μL，流速0.40 mL/min。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱条件见表1。

1.3.5 質谱条件。

电喷雾离子源正模式（ESI+），分段多反应监测（MRM）采集，扫描窗口60 s。雾化电压5 500 V（正），-4 500 V（负）;气帘气206.8 kPa;离子源温度500 ℃;雾化气344.7 kPa;辅助加热气413.7 kPa。

16种非甾体消炎药各化合物的信息及保留时间（RT）、离子对（Q1/Q3）、去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等质谱参数见表2。

2 结果与分析

2.1 仪器参数优化

质谱条件中的碰撞能量对离子丰度具有较大影响，对方法灵敏度有决定性作用。碰撞能量过高时，由母离子生成的碎片过多，子离子响应过低;碰撞能量过低时，不能生成所需的子离子[18]。该试验通过针泵将标液注入离子源进行分析，得到母离子，同时优化去簇电压。对母离子进行二级质谱扫描，得到碎片离子信息，选取2～3个响应较高且稳定的特征性子离子，同时优化碰撞能量。优化离子源温度、雾化电压、雾化气、气帘气、辅助加热气等条件，选取合适的质谱条件。

采用0.1%甲酸水-乙腈体系，以0.4 mL/min的流速梯度洗脱。优化流动相梯度，使16种化合物的保留时间尽量分散。16种非甾体消炎药MRM模式下总离子流如图1所示。

2.2 样品提取方法优化

乙腈是兽药残留检测中最常用的提取溶剂，能够提取出大多数的药物，同时引入更少的杂质[19]。该试验研究了前处理中不同乙腈∶水的比例（体积比）和不同甲酸含量对猪肉和鸡蛋样品中非甾体消炎药回收率的影响。试验分为2组，第1组提取溶剂中甲酸含量固定为0.1%，乙腈含量分别设定为70%、80%、90%，相应的回收率情况见图2;第2组提取溶剂中乙腈∶水溶液体积比固定不变为8∶ 甲酸含量分别设定为0.1%、0.2%、0.5%，相应的回收率情况见图3。

從图2、3可以看出，无论是猪肉还是鸡蛋样品中绝大多数非甾体消炎药在提取溶剂中乙腈∶水的比例（体积比）为9∶1时，回收率相对较高。可能是因为水相占比过高时，提取液容易混入更多的杂质，不利于净化。另外，猪肉样品中绝大多数非甾体消炎药选用0.1%甲酸前处理回收率相对更高;鸡蛋样品中绝大多数非甾体消炎药选用0.5%甲酸前处理回收率相对更高。因此建议猪肉样品选用0.1%甲酸-90%乙腈溶液进行提取，鸡蛋样品选用0.5%甲酸-90%乙腈溶液进行提取。

2.3 基质效应

基质效应普遍存在于质谱检测中。消除基质效应的方法比较多，如充分净化样品、用基质匹配标准曲线[20-21]、用同位素做内标校正[22]、加入分析保护剂[23]等。该试验通过对猪肉和鸡蛋的空白基质匹配标准曲线与纯溶剂曲线进行比较分析，发现经过该试验方法前处理后，依然存在基质效应，尤其对氟尼辛、甲灭酸、萘丁美酮的影响较大。因此，该试验最终采用基质匹配标准曲线进行定量，即分别在猪肉和鸡蛋的空白基质中，添加一定浓度的标准溶液，经过前处理后进行测定，以此来消除基质效应对结果的影响。

2.4 方法学验证

以各目标物的定量离子的响应值为纵坐标（Y）、质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得到线性回归方程如表3所示。结果表明，16种非甾体消炎药在1～200 ng/mL线性关系良好（R2>0.995）。

在猪肉和鸡蛋中分别添加1倍定量限（2.0 μg/kg）、2倍定量限（4.0 μg/kg）和10倍定量限（20.0 μg/kg）3个水平的混合标准溶液进行回收率试验，每个添加水平进行6次平行测定，具体见表3。结果表明，加标回收率在70%～105%，相对标准偏差（RSD）均在15%以下。

2.5 实际样品的测定

该试验从苏州农贸市场上购买了15批猪肉和15批鸡蛋样品，并用所建立的方法进行了检测，结果显示16种非甾体消炎药兽药残留全为未检出。接下来将扩大样本量，尤其是对水产类样品进行进一步筛查。除猪肉、鸡蛋样品中，该试验同时在鱼肉、虾肉和牛奶样品中进行加标，获得了较稳定的回收率。

3 结论与讨论

该研究通过对质谱条件、提取溶剂浓度等因素进行优化，采用基质匹配标准曲线减弱基质效应，建立了UPLC-MS/MS定量检测动物源性食品中16种非甾体消炎药残留量的方法。该方法前处理简单，具有较好的重现性、稳定性和准确度，为动物源性食品中16种非甾体消炎类兽药残留的检测提供了可靠的技术支持。

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