肝细胞肝癌治疗前后MRI-PWI参数、sFas、miR-224含量变化及对短期生存状况的预测价值

朱 宏 郑雪丽 黄宝生 王颖超 燕丽红

（1.河西学院附属张掖人民医院；2.河西学院临床医学院，甘肃 张掖 734000）

据统计，肝细胞肝癌（Hepatocellular carcnoma，HCC）病死率居所有癌症相关死亡的第2 位，严重威胁患者生命安全，给予HCC 患者及时有效治疗尤为重要［1-2］. 目前经皮肝动脉化疗栓塞术（Transcatheter hepatic arterial chemoembolization，TACE）在HCC 患者中应用价值受到临床医师广泛认可，但对其疗效评估方面存在一定争议［3］.磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）是评估TACE疗效的影像学手段之一，但其多依赖于肿瘤形态学改变评估疗效，具有一定局限性.而磁共振灌注成像（MRI-perfusion weighted imaging，MRI-PWI）通过灌注参数值进行定量分析，能有效弥补MRI不足.可溶性Fas（Soluble Fas，sFas）是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，在HCC患者中呈过表达［4］.新近研究表明，微小RNA-224（microRNA-224，miR-224）可促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭，并抑制其凋亡［5］，但关于其与HCC患者疗效、生存状况关系尚需进一步探究.鉴于此，本研究选取89例HCC患者，观察MRI-PWI参数、sFas、miR-224含量变化，分析其与疗效、短期生存状况关系，以期为临床确定治疗措施提供依据.

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018 年1 月～2019 年10 月我院89 例HCC 患者作为研究对象，（1）纳入标准：符合《内科学》HCC诊断标准［6］，结合病理检查确诊；年龄18～80岁；Child-Puch分级B级、C级；均成功施行TACE；生存周期＞12周；患者及家属知晓并签署同意书；（2）排除标准：其他恶性肿瘤者；心脑血管疾病者；入组前4周接受免疫制剂治疗者；MRI-PWI不耐受者.其中男48例，女41例；年龄18～80岁，平均（49.11±13.89）岁；体质量指数（BMI）18～25 kg/m2，平均（21.56±1.38）kg/m2；肿瘤数目：38例≥2个，51例＜2个；肿瘤直径：35例≥5cm，54例＜5cm；分化程度：37例中高分化，52例低分化；Child-Puch 分级：49 例B 级，40 例C 级；微血管浸润：37 例有，52 例无；淋巴结转移：35例有，54例无.本研究经医院伦理委员会审核批准.

1.2 方法

1.2.1 MRI-PWI 检测 检查前，禁食12h，仰卧位，叮嘱受检者胸式呼吸，应用GE Discovery MR 750 3.0 T MR扫描仪及8通道体部相控阵线圈，先行常规轴位T1WI、T2WI扫描，随后经高压注射液于肘前静脉团注对比剂扎喷酸葡胺注射液，剂量0.2mmol/kg，速度4ml/s，同时追加20ml生理盐水，更换至PWI模式，定位像为屏气冠状位T1WI，使用body线圈，快速扰相GRE序列，TE1.3ms，TR5.3ms，矩阵256×256，FOV34×26，层厚8.0mm，NEX1.0，间隔2.0mm，扫描时间3min，每3s进行1 次全肝采集.所得原始图像上传至AW4.3 工作站，以相关软件处理，选取病灶横截面积最大、信号最强的层面绘制感兴趣区（ROI），获得容积转运常数（Ktrans）、血管外细胞外间隙容积比（Vc），所有数据连续测量3次，取均值.由2名高年资医师盲法判断，意见不统一时，请教上级医师，得出统一结论.

1.2.2 血清指标检测 （1）标本采集：清晨8：30～9：30，抽取4ml 外周静脉血，分为两份（各2 ml），静置20min，以2500r/min速度离心15min，取上清液，-70℃保存备用.（2）sFas：应用全自动生化分析仪（日本日立公司，HITACHI7180型），以双抗体酶联免疫法测定血清sFas水平.由我院检验科医师完全参照试剂盒说明书操作.（2）miR-224：取2ml 血清标本，参照德国Qiagen 公司提供miRNeasy 血清试剂盒提取总RNA，RNA 质量以分光光度计评估，所有洗脱RNA 样品经DNA 酶Ⅰ（Sigma）处理；以miScriptⅡRT 试剂盒（Aiagen）逆转录成熟miRNA，参照Applied Biosystem 7500 实时RCP系统进行实时定量聚合酶链式反应（QRT-PCR），反应体系20 μl，反应条件：94℃预变性2min，94℃20s，60℃30s，60℃34s，共35～40 个循环反应，miR-224 引物：s：5，-GTCGTATC⁃CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAAACG-3，as：5，-CGCAAGTCCTAGTG⁃GTTCCG-3，；U6引物：s：5，-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，，as：5，-AACGCTTCACGAATTTGC⁃GT-3，，上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成，每个miRNA的相对表达量用2-△△Ct表示，△△Ct=（CtHCC-miR224-CtHCC-u6）-（CtNC-miR224-ctNC-u6），每个样本重复3次试验.

1.2.3 治疗方法 所有患者均行TACE，利多卡因（浓度2%）局麻，Terumo股动脉专用套管针进行一次性穿刺，置入5F动脉鞘管，先行腹腔动脉、肝总动脉及肠系膜上动脉常规造影，确定肿瘤大小、部位、血供，自肿瘤供血血管注入25mg吡柔比星+700mg氟尿嘧啶，同时将10mg吡柔比星与2 ml碘化油混合液与一定量明胶海绵颗粒栓塞靶动脉，每月1次，连用2次，术后常规给予保肝、抗生素、止痛等药物.

1.3 疗效评价

参照实体瘤疗效评价标准评估，完全缓解（CR）：目标病灶动脉期增强显影消失；部分缓解（PR）：目标病灶直径总和缩小30%及以上；疾病稳定（SD）：目标病灶直径总和缩小29%及以下；疾病进展（PD）：目标病灶直径总和增大20%及以上，或出现新病灶.将CR、PR、SD 归入稳定，PD归入进展.

1.4 观察指标

（1）HCC患者治疗前、治疗后4周MRI-PWI参数、血清sFas、miR-224水平.（2）不同疗效患者治疗前、治疗后4周MRI-PWI参数、血清sFas、miR-224水平.（3）不同生存状况治疗前、治疗后4周患者MRI-PWI 参数、血清sFas、miR-224水平.（4）MRI-PWI参数、血清sFas、miR-224水平单一或联合预测HCC死亡价值.（5）MRI-PWI参数、血清sFas、miR-224水平与HCC患者死亡关系.

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 治疗前后各指标

89例HCC患者治疗后4周miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于治疗前（P＜0.05）.见表1.

表1 治疗前后各指标（±s）

表1 治疗前后各指标（±s）

时间治疗前治疗后4周n 89 89 t P Ktrans（min）1.36±0.25 0.42±0.11 32.468＜0.001 Vc（%）0.55±0.19 0.41±0.07 6.523＜0.001 sFas（μg/L）5.32±1.28 2.40±0.31 20.917＜0.001 miR-224 3.66±1.02 1.47±0.53 17.974＜0.001

2.2 进展及稳定患者治疗前后各指标

治疗前进展及稳定患者sFas、miR-224、Vc、Ktrans比较，无显著差异（P＞0.05），治疗后4周稳定患者miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于进展患者（P＜0.05）.见表2.

表2 进展及稳定患者治疗前后各指标（±s）

表2 进展及稳定患者治疗前后各指标（±s）

时间n治疗前组别稳定进展40 49 tP稳定治疗后4周进展40 49 tP Ktrans（min）1.37±0.26 1.35±0.28 0.331 0.742 0.31±0.10 0.51±0.21 5.530＜0.001 Vc（%）0.56±0.17 0.54±0.18 0.535 0.594 0.27±0.06 0.52±0.12 11.999＜0.001 sFas（μg/L）5.34±1.25 5.30±1.28 0.141 0.888 2.23±0.28 2.61±0.34 5.783＜0.001 miR-224 3.67±1.01 3.65±1.04 0.091 0.927 1.30±0.48 1.61±0.57 2.737 0.007

2.3 生存及死亡患者各指标

治疗后随访12 周，发现12 例死亡，77 例生存.治疗前生存及死亡患者sFas、miR-224、Vc、Ktrans比较，无显著差异（P＞0.05），治疗后4周生存患者miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于死亡患者（P＜0.05）.见表3.

表3 生存及死亡患者治疗前后各指标（±s）

表3 生存及死亡患者治疗前后各指标（±s）

时间n治疗前组别生存死亡77 12 t P生存治疗后4周死亡77 12 t P Ktrans（min）1.35±0.29 1.42±0.22 0.799 0.426 0.33±0.10 1.00±0.31 14.938＜0.001 Vc（%）0.54±0.21 0.61±0.14 11.114 0.268 0.30±0.09 1.12±0.35 2.830 0.006 sFas（μg/L）5.31±1.58 5.38±1.54 0.143 0.886 2.21±0.66 3.62±1.08 6.252＜0.001 miR-224 3.65±1.13 3.72±1.01 0.202 0.840 1.32±0.40 2.43±0.73 7.858＜0.001

2.4 单一及联合预测HCC患者死亡价值

ROC 显示，联合预测HCC 患者死亡价值的AUC 为0.881（95%CI：0.795～0.940），诊断敏感度及特异度分别为83.33%、89.61%，其次为Ktrans 0.827（0.733～0.899）、Vc 0.811（0.714～0.886）、miR-224 0.805（0.708～0.882）、sFas 0.797（0.699～0.875）.见表4，图1～2.

图1 单一预测HCC患者死亡价值

表4 单一及联合预测HCC患者死亡价值

图2 联合预测HCC患者死亡价值

2.5 各指标与生存状况关系

根据ROC分析sFas、miR-224、Vc、Ktrans最佳截断值分为高危组和低危组.KM曲线显示，sFas、miR-224、Vc、Ktrans 高危组生存率低于低危组（χ2分别为8.667、6.489、4.680、6.782，P＜0.05）.见图3～6.

图3 sFas与生存状况关系

图4 miR-224与生存状况关系

图5 Vc与生存状况关系

图6 Ktrans与生存状况关系

2.6 logistic回归分析影响HCC患者死亡因素

以HCC患者是否死亡作为因变量，分化程度、肿瘤直径、Child-Pugh 分级、肿瘤数目、微血管侵犯、淋巴结转移、sFas、miR-224、Vc、Ktrans 作为自变量纳入logistic 回归模型，结果显示，低分化程度、肿瘤直径≥5cm、肿瘤数目≥2个、Child-Pugh 分级C级、微血管侵犯、淋巴结转移、sFas≤2.50μg/L、miR-224＞2.06、Vc＞0.82%、Ktrans＞1.01min是影响HCC患者死亡危险因素（P＜0.05）.见表5.

表5 logistic回归分析影响HCC患者死亡因素

3 讨论

HCC是恶性程度最高肿瘤性疾病，易于复发和远处转移，因而临床治疗效果差，病死率高［7］.发病初期，HCC 患者无特异性临床表现，确诊时已属中晚期，需采取TACE 等介入治疗.TACE 作用机制是将抗癌药物直接作用于病变部位，杀伤肿瘤细胞，结合栓塞可影响肿瘤细胞血供，导致肿瘤细胞死亡，但其无法完全杀伤肿瘤细胞，需行多次TACE，特别是瘤体巨大者［8-9］.如何客观评价TACE疗效，了解TACE介入术后肿瘤坏死程度，对临床调整治疗方案具有积极意义.

目前，TACE的疗效判断主要依赖于MRI，但常规肝脏MRI检查序列多局限于形态学，随医学技术快速发展，影像医学正从单纯形态学逐步向形态学结合反映细胞、分子水平生理生化改变的功能学检查发展［10-11］.PWI可无创性反映组织血管化程度及血流灌注情况，量化分析组织及肿瘤血管动力学方面信息，现已广泛应用于神经系统、肌肉骨关节系统.传统观念认为，PWI易受脉搏、呼吸、肠道蠕动等因素影响，难以在肝脏、胃等腹部脏器广泛应用［12］.近年随磁共振快速及超快速成像序列开发及应用，成像时间、信噪比得到明显改善，腹部磁共振灌注成像质量得到明显提高，对实现磁共振肝脏灌注成像提供有利依据.本研究给予89例接受TACE 的HCC患者MRI-PWI检查，结果发现，治疗后4周Ktrans低于治疗前，且稳定患者Ktrans低于进展患者（P＜0.05），与朱正［13］研究结果相符，提示Ktrans值越低，HCC患者TACE疗效越好.Vc是对比剂在组织血管外细胞外间隙所占容积比，资料显示，恶性肿瘤Vc值高于正常组织，并指出对TACE治疗有效的肿瘤组织Vc值会降低［14］，究其原因在于，TACE 治疗后，肿瘤血供受化疗药物、碘油填充破坏较大，坏死较彻底，肿瘤体积缩小更为明显，Ktrans 及Vc值下降越明显.本研究随访12周发现，生存患者Vc、Ktrans 低于死亡患者（P＜0.05），说明Vc、Ktrans 升高可能与HCC 患者生存状况有关.ROC 显示，Vc、Ktrans 升高可作为HCC 患者死亡预测指标之一. logistic 回归分析显示，Vc＞0.82%、Ktrans＞1.01min为患者死亡的独立危险因素，提示MRI-PWI 参数升高会增加HCC 患者死亡风险，需及时给予相应治疗.

HCC发生发展与细胞凋亡密切相关，而sFas可能是肝癌细胞凋亡途径之一［15］.sFas可结合sFas配体，刺激半胱天冬蛋白酶，导致细胞发生蛋白水解，诱导肝癌细胞凋亡.亦有研究表明，原发性肝癌患者血中sFas水平高于健康体检者［16］.sFas可抑制FasL诱导的淋巴细胞凋亡，增加体内激活淋巴细胞数量，参与原发性肝癌病理过程.鲁玉娟等［17］研究指出，香菇多糖联合TACE可降低原发性肝癌患者sFas水平.但目前关于HCC患者经TACE治疗后sFas水平变化研究较少，故本研究对此进行分析，发现治疗4周后血清sFas水平低于治疗前，且稳定患者低于进展患者，可能与TACE治疗后肿瘤病灶肝动脉及门静脉供血得到治疗有关，亦从侧面反映高sFas 可能与HCC 患者TACE 治疗疗效有关.本研究还发现，治疗4 周后生存患者sFas 低于死亡患者（P＜0.05），说明HCC 患者sFas持续升高会导致淋巴细胞凋亡延迟，加剧肝组织损伤，进而导致患者死亡.ROC 显示，sFas 预测HCC 患者死亡价值的AUC 为0.797.logistic 回归分析显示，sFas 是HCC 患者死亡的独立危险因素.上述结果均说明sFas水平越高，HCC患者死亡风险越大，建议临床及时采取治疗措施，以降低死亡率.

近年miR-224与肿瘤形成、复发转移关系成为当前生物医学研究热点领域.相关研究指出，血清miR-224 在HCC 患者中平均表达量约为健康人的10 倍，推测是由于肝癌组织中高表达的miR-224 以一定方式释放入外周血所致［18］.亦有学者发现，血清miR-224 浓度与肝癌组织浓度呈正相关，手术切除肿瘤组织后，其浓度明显下降［19-20］.上述结果提示HCC患者血清miR-224浓度升高可能与肿瘤组织有关，但其释放机制尚未清晰.本研究结果显示，89例HCC患者治疗后4周miR-224低于治疗前，且稳定患者低于进展患者（P＜0.05），可能与TACE能缩小肿瘤体积，降低血清miR-224 水平有关，同时说明miR-224 有望成为评估TACE 疗效的生物学标志物之一.另有研究报道，血清miR-224 与HCC 患者临床分期、病理分化程度密切相关，可增加肿瘤侵袭性，引起肿瘤转移，加剧病情进展，降低患者生存率［21］.本研究还发现，治疗后4周生存患者miR-224低于死亡患者（P＜0.05），说明miR-224对HCC患者死亡具有一定预测价值.同时多因素回归分析显示，miR-224 是HCC 患者死亡独立危险因素，有助于临床医师早期预测死亡风险，确定合理治疗方案.此外，ROC 曲线显示，联合预测HCC 患者死亡价值的AUC 为0.881，提示临床应重视MRI-PWI 参数、sFas、miR-224联合预测HCC死亡价值，及时调整治疗方案，降低HCC患者死亡风险.

综上可知，HCC患者TACE治疗后MRI-PWI参数、sFas、miR-224较治疗前减低，联合检测能较好预测HCC患者生存状况，为临床诊治提供科学依据.