七味葡萄散对哮喘模型大鼠哮喘症状和肺部损伤的改善作用

王 锦 马玮玮 刘 燕 刘小玲 姜现瑞 张娟娟

（河西学院医学院，甘肃 张掖 734000）

支气管哮喘（Bronchial asthma，简称哮喘）是一种呼吸道慢性炎症性疾病，在我国哮喘的患病率呈快速上升趋势［1］，严重影响患者的生活质量.中医药在治疗哮喘方面历史悠久，临床经验丰富.七味葡萄散（Qiwei grape powder）系蒙古族验方，具有清肺、止咳、定喘等功能［2］.本研究采用卵蛋白致支气管哮喘大鼠模型，应用七味葡萄散对哮喘模型大鼠进行灌胃干预治疗，观察大鼠行为学表现，并在光镜下观察肺部损伤的组织病理学改变，评价七味葡萄散对哮喘模型大鼠肺部损伤的影响，以进一步探讨七味葡萄散治疗哮喘的作用机制.

1 材料

1.1 药物：白葡萄干15g，石膏12.5g，香附11.5g，石榴11g，甘草9g，红花5.5g，肉桂5.5g.制法除白葡萄干外，其余石膏等六味粉碎成粗粉，加白葡萄干，粉碎，烘干，再粉碎成细粉，过筛，混匀，即得.七味葡萄散由阜新蒙药有限责任公司提供.

1.2 动物：Wistar大鼠，雌雄各半，体重180～220g，甘肃中医药大学实验中心购买，SPF级环境饲养，室温20～26℃，实验动物伦理委员会批准编号1509005，动物饲料也由上述单位提供.

1.3 试剂：氢氧化铝（天津市光复精细化工研究所）、卵清蛋白OVA（sigmaA5503卵白蛋白）、水合氯醛（郑州优然食品化工有限公司）、多聚甲酵溶液（丹东市龙海试剂厂）.

2 方法

2.1 分组及疾病模型建立：30 只大鼠随机分为空白对照组、哮喘模型组、七味葡萄散干预组［0.15g/（kg·d）］，每组10 只.哮喘模型组、七味葡萄散干预组用10%卵清蛋白（OVA）1.0ml 致敏液（致敏液由100mgOVA、100mg氢氧化铝和800mg生理盐水配置成1ml混悬液）进行腹腔注射，共注射3次（第1日，第7日，第14日），第15日开始，在口鼻全相态毒性实验设备中以10%卵清蛋白雾化激发，连续激发两周（每日一次，一次20min）.空白对照组腹腔注射1.0ml生理盐水和生理盐水雾化，次数及方法同其他2组.七味葡萄散干预组在每次雾化激发前30min，给予七味葡萄散（［0.15g/（kg·d）］）灌胃（药物按人与动物体表面积比率换算：大鼠用量=人口服总量×大鼠与人体表比）.空白对照组和哮喘模型组每次雾化激发前给与相同剂量的生理盐水灌胃.

2.2 行为学评价：根据文献［3］介绍的方法，对末次激发引喘后大鼠进行行为学及呼吸系统症状程度的评分，用以评价大鼠症状表现程度，具体评分标准：0分：呼吸正常或仅有呼吸急促；1分：颤动或点头；2分：咳嗽或呼吸加深；3分：节律性收腹样喘促；6分：跌倒.

2.3 取材及标本制备：标本制备与处理：连续14天雾化激发后，在第15天用水合氯醛在大鼠腹部进行注射麻醉，麻醉后取右肺上叶肺组织，并置于甲醛溶液进行固定.将固定好的肺组织采用常规石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察.

2.4 肺组织损伤病理学评分：根据文献［3］介绍的方法，采用双盲病理评分法，对大鼠肺组织HE染色病理切片进行肺组织损伤病理学评分，即由两位病理专科医生根据炎性细胞浸润、支气管上皮细胞脱落、肺泡间隔增厚等三项指标进行分级评分，计算总分，并根据两位病理科医生评分结果最后计算平均分，用以半定量评估肺组织损伤程度.支气管上皮细胞脱落评分标准：0分：正常（无或偶见黏膜上皮鳞状上皮化生）；1分：轻度脱落（黏膜上皮鳞状上皮化生，偶见上皮细胞脱落）；2分：中度脱落（黏膜上皮鱗状上皮化生，上皮细胞部分脱落，露出固有膜）；3分：重度脱落（黏膜上皮鳞状上皮化生，上皮细胞成片脱落，固有膜破坏）.肺泡间隔增厚评分标准：0分：正常（无肺泡间隔增厚）；1分：轻度增厚（肺泡间隔增厚至正常厚度的1～2倍）；2分：中度增厚（肺泡间隔增厚至正常厚度的3～5倍）；3分：重度增厚（肺泡间隔增厚至正常厚度的5倍以上）.炎性细胞浸润评分标准：0分：正常（无或偶见炎性细胞浸润）；1分：轻度细胞浸润（散在炎性细胞浸润，或偶可见部分聚集成团）；2分：中度细胞浸润（炎性细胞聚集成团，但尚未侵及支气管黏膜下层）；3分：重度细胞浸润（大量炎性细胞成团浸润，侵及支气管黏膜下层甚至黏膜层）.

3 统计学分析

4 结果

4.1 大鼠行为学表现及评价

在雾化激发阶段，空白对照组大鼠呼吸频率均匀、毛发光滑、进食正常.哮喘模型组大鼠均不同程度的出现呼吸急促、挠脸、烦躁不安、点头、颤动、咳嗽、节律性收腹样喘促、跌倒、反应迟钝、进食减少、大便稀溏、皮毛黄湿脱落无光泽等.七味葡萄散干预组上述症状表现比较轻.对末次激发引喘后各组大鼠进行行为学症状程度评价（如表1），与空白对照组相比，哮喘模型组和七味葡萄散干预组大鼠行为学症状程度评分均明显升高，均具有统计学差异（P<0.01）.七味葡萄散干预组与哮喘模型组相比，大鼠行为学症状程度评分均减少，且具有统计学差异（P<0.05）.整体来看，各组大鼠行为学评分由大到小依次为：哮喘模型组>七味葡萄散干预组>空白对照组，呈逐渐递增趋势.

表1 末次激发引喘后各组大鼠行为学症状程度评分表（分，±s）（n=10）

表1 末次激发引喘后各组大鼠行为学症状程度评分表（分，±s）（n=10）

注：与空白对照组相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与哮喘模型组相比＃P<0.05.

组别空白对照组哮喘模型组七味葡萄散干预组行为学症状程度评分0.300±0.152 3.600±1.776＊＊1.600±0.699＊＊＃

4.2 肺组织病理切片HE染色观察

空白对照组：支气管和肺组织结构清晰，肺泡结构完整，肺泡腔、肺间质均未见炎症细胞浸润（如图①）.极个别空白对照组肺组织HE染色切片可见肺内可见细支气管上皮有少量脱落，围绕细支气管周围的结缔组织可见淋巴细胞和少许粒细胞浸润，肺泡间隔稍有增厚，但均属轻度.

哮喘模型组：肺组织可见明显的病理损伤.肺泡和支气管结构不完整，支气管壁纤维组织和平滑肌细胞增生增厚，管壁水肿、粘膜上皮部分脱落，肺泡腔内和支气管壁可见大量炎性细胞浸润，炎性细胞主要是巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞，肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡间隔明显增厚（如图②）.

七味葡萄散干预组：与模型组比较肺组织损伤较轻.在支气管和血管周围可见少量的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞；肺泡结构基本完整，肺泡上皮细胞及肺间隔损伤较轻，毛细血管轻度充血，部分肺泡腔内可见少量的炎性细胞和红细胞渗出；支气管结构基本完整，管壁结构清晰未见明显的纤维组织的增生和平滑肌细胞增生，气道上皮细胞排列整齐、上皮细胞几乎未见明显的损伤（如图③）.

显微镜下各组大鼠肺组织病理形态学改变（HE染色，×200）图①为空白对照组；图②为哮喘模型组；图③为七味葡萄散干预组

4.3 肺组织HE染色半定量分析

依据大鼠肺组织损伤病理学评分标准，对炎症细胞浸润、支气管上皮细胞脱落、肺泡间隔增厚等方面进行评分统计，并进行两两比较（如表2）.与空白对照组相比，哮喘模型组和七味葡萄散干预组大鼠肺组织损伤病理学评分均增加，具有统计学差异（P<0.05或P<0.01）.七味葡萄散干预组与哮喘模型组相比，大鼠肺组织损伤病理学评分减少，且具有统计学差异（P<0.05或P<0.01）.整体来看，各组大鼠肺组织损伤病理学评分从高到低依次为：哮喘模型组>七味葡萄散干预组>空白对照组，呈逐渐递减趋势.

表2 各组大鼠肺组织损伤病理学评分表（分，±s）（n=10）

表2 各组大鼠肺组织损伤病理学评分表（分，±s）（n=10）

注：与空白对照组相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与哮喘模型组相比＃P<0.05，＃＃P<0.01.

组别空白对照组哮喘模型组七味葡萄散干预组总分1.300±1.828 6.500±1.433＊＊3.900±1.197＊＊＃＃炎细胞浸润0.600±0.843 2.400±0.516＊＊1.400±0.516＊＃＃支气管上皮脱落0.400±0.699 2.400±0.516＊＊1.300±0.483＊＊＃＃肺泡间隔增厚0.300±0.483 1.700±0.674＊＊1.200±0.421＊＊＃

5 讨论

支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的慢性气道炎症性疾病，主要表现为气道炎症、气流受限和气道高反应性［4］.在临床上最常见的三个症状为咳嗽、胸闷和气促［5］.目前对哮喘暂无有效的根治方法，其治疗仍是以控制症状为主，治疗药物有吸入性糖皮质激素、β2受体激动剂、抗胆碱能药物及白三烯调节剂等，其中吸入性糖皮质激素是治疗哮喘最有效的药物，但部分哮喘患者常规吸入糖皮质激素治疗无效［6］，且高剂量吸入激素可增加条件致病菌感染的患病率［7］.

中药在治疗哮喘上有着悠久的历史和独到的疗效，中药能控制气道炎症，延缓气道重建，调节免疫和神经内分泌，具有多环节、多靶点、多途径等特点［8，9］.临床研究发现［10，11］七味葡萄散在治疗慢性阻塞性肺疾病方面有较好的疗效.七味葡萄散系蒙古族验方，源于《医法海鉴》，被收入在《中华人民共和国药典》2020年版一部，由白葡萄干、红花、甘草、肉桂等配合组成，具有清肺、止咳、定喘等功能［2］.方中以性凉，味甘，清肺热、止咳平喘良药白葡萄干为主；配合以凉血益肝良药红花，止咳益肺良药石膏、甘草、香附，加配以石榴、肉桂等.从现代医学角度，七味葡萄散平喘作用机制未见报道.本实验利用卵清蛋白致敏和激发大鼠，建立哮喘大鼠模型并使用七味葡萄散进行干预，观察七味葡萄散的平喘作用及其机制.

咳嗽、胸闷和气促是哮喘的主要症状，是气道炎症、气道高反应性、气道重塑等病理改变反应于外的表现.减轻疾病外部表现是改善病理改变的必要依据，是哮喘疾病诊断和防治疗效评价的主要内容［3］.本实验对末次激发引喘后大鼠进行行为学评价，结果显示，哮喘模型组和七味葡萄散干预组较空白对照组行为学程度评分均升高，且具有统计学差异，说明本实验成功建立了哮喘动物模型.七味葡萄散干预组与哮喘模型组相比，大鼠行为学症状程度评分减少，且具有统计学差异，说明七味葡萄散可减轻哮喘哮喘模型大鼠的哮喘症状.

气道炎症是哮喘发病的基础［8］，浸润的炎性细胞以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等为主［12］.本实验肺组织病理学显示，哮喘模型组大鼠肺组织肺泡壁结构受损，肺泡壁增厚，支气管腔狭窄，黏膜上皮细胞脱落，支气管与血管周围重度炎性细胞浸润，炎性细胞主要是巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞；七味葡萄散干预后，能改善哮喘大鼠炎症细胞浸润、支气管上皮细胞脱落、肺泡间隔增厚等肺组织病理损伤.大鼠肺组织损伤半定量评价结果显示，与空白对照组相比，哮喘模型组和七味葡萄散干预组大鼠肺组织损伤病理学评分均增加，具有统计学差异.七味葡萄散干预组与哮喘模型组相比，大鼠肺组织损伤病理学评分减少，具有统计学差异.说明七味葡萄散对哮喘模型大鼠具有一定的防治作用.

综上所述，七味葡萄散作为一种中药制剂，在卵清蛋白诱发的哮喘模型大鼠中，具有改善哮喘模型大鼠的症状和减轻哮喘模型大鼠气道病理损伤的作用，但具体的细胞学、分子学作用机制仍有待进一步研究.