齐墩果酸诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

孙阳，孙悦，吴勃岩，陶雪莲，姜德友

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

齐墩果酸(Oleanolic Acid,OA)是五环三萜类化合物，它是一种天然化学成分，存在于多种植物药物中[1-3]。中药复方贞术消积汤，由女贞子、夏枯草、白花蛇舌草、莪术和甘草组成，其中君药女贞子、臣药白花蛇舌草和夏枯草均含有齐墩果酸。课题组研究证实该复方对肝癌有抑制作用[4]。文献报道，齐墩果酸可以抑制HepG2肝癌、结肠腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌等细胞增殖、转移，诱导细胞凋亡和自噬发挥抗肿瘤作用[5-8]。课题组前期也开展了齐墩果酸在体实验，发现药物抑制H22肝癌细胞增殖，通过线粒体途径诱导细胞凋亡[9]，但由于齐墩果酸不溶于水和油，限制了药物吸收和生物利用度,本实验制备齐墩果酸自微乳开展离体实验研究。

1 实验材料

1.1 细胞株

人肝癌SMMC-7721细胞购于武汉博士德生物公司(编号：CX0296)。

1.2 药品与试剂

齐墩果酸(美伦生物公司，编号：MB6817)、顺铂(Sigma公司，编号:MKBV3446V)；蓖麻油(阿拉丁试剂公司，编号：8001-79-4)、吐温80(天津市富宇精细化工有限公司，批号：20140901)、蓖麻油聚氧乙烯醚(麦克林公司，编号：61791-12-6)、PEG400(天津市光复精细化工研究所，批号:20131112)、 四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma公司，编号：M-2128)；AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天公司，编号：C1062)；Bcl-2、Bax和GAPDH抗体(Abcam公司，编号分别为ab182858、ab32503和ab128915)，p-Akt(Ser473)和Akt抗体(CST, 编号为9272和4060)。

1.3 主要实验仪器

Multiskan MK3酶标仪、BDAira流式细胞仪、EVOS FL Auto倒置荧光显微镜、Wiggens磁力搅拌器、MX3000P Real-time PCR仪。

2 实验方法

2.1 制备齐墩果酸自微乳

齐墩果酸(OA)与蓖麻油、吐温80、蓖麻油聚氧乙烯醚、PEG400(20:16:34:30)混合，OA的浓度为30 mg·g-1。将其置于50 ℃水浴中温和搅拌直至药物完全溶解，呈白色黏稠液体；同时制备无齐墩果酸的空白自微乳。分别取二者加蒸馏水稀释制成白色和无色透明微乳液，放置于4 ℃冰箱，2日后观察无杂质析出,将制备的微乳液滤菌，4 ℃保存备用。

2.2 细胞培养

SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，于5%CO2、37 ℃培养箱中常规培养。细胞密度达到80%时，0.25%胰酶消化，1∶3传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

2.3 细胞分组及给药

实验细胞分为模型对照组、齐墩果酸组和顺铂组。药物与完全培养液混合，齐墩果酸和顺铂的终浓度分别为80 μg·mL-1和15 μg·mL-1，作用时间均为24 h。

2.4 MTT实验

将对数生长期的肝癌细胞消化成单细胞悬液接种于96孔板，每孔接种密度为5×104个，模型对照组加入完全培养液培养(无齐墩果酸)，实验组分别加入20、40、60、80、100、120、140、160、180 μg·mL-1齐墩果酸自微乳，空白对照组加入空白自微乳培养液，培养24 h后每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h后弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡摇匀后，于波长570 nm处读取OD值。细胞存活率=(实验组OD-调零组OD)/(模型对照组OD-调零组OD)×100%，每组设定5个重复孔，计算平均值。

2.5 细胞培养液中IL-6含量的测定

Elisa法检测IL-6含量。收集各组细胞培养液上清，离心去除沉淀等杂质，按照试剂盒说明书进行操作。每次检测均做标准曲线，根据样品的吸光度值在坐标上找到对应的浓度。

2.6 荧光显微镜观察细胞形态

肝癌细胞接种于6孔板中，将80 μg·mL-1齐墩果酸和15 μg·mL-1顺铂处理细胞24 h，用AnnextinV-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒染色，室温下避光作用10 min，荧光显微镜下观察，AnnexinV-FITC染色阳性细胞呈绿色荧光，PI染色阳性细胞呈红色荧光，未被荧光染色的是正常细胞，仅为绿色荧光的是早期凋亡细胞，红、绿色荧光双染的是晚期凋亡或坏死细胞。

2.7 流式细胞术检测肝癌细胞凋亡

将齐墩果酸和顺铂作用于6孔板中的肝癌细胞，24 h后PBS冲洗、胰酶消化收集细胞，用AnnextinV-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒染色，流式细胞仪检测各组荧光强度，FACSDiva Version6.1软件分析，比较各组总凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率。

2.8 细胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA表达

收集各组细胞，提取RNA，琼脂糖凝胶电泳法分析其完整度。各基因引物分别为：Bax 上游5′-CCCTTTTCTACTTTGCCAGCA-3′，下游5′-GGAGTCTCACCCAACCACCC-3′，150 bp;Bcl-2上游5′-CCCTGTGGATGACTG AGTACCTG-3′，下游5′-GCCGTACAGTTCCACAAAGGC-3′，89 bp;Akt上游5′-ACCTTCCATGTGGAGACTCCTGAG-3′，下游5′-GTCCATCTCCTCCTCCTCCTGC-3′，99 bp;GAPDH上游5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，下游5′-AGTCCTT CCACGATACCAAAGT-3′，113 bp。

2.9 Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表达

收集各组细胞，蛋白裂解液作用后收集上清，测定蛋白浓度。取蛋白20 μg加入上样缓冲液，95 ℃条件下变性10 min。经过凝胶电泳、转膜、封闭、加入Bax、Bcl-2、Akt(抗体浓度1∶1 000)、p-Akt(抗体浓度1∶300)，GAPDH(抗体使用浓度1∶10 000)，4 ℃孵育过夜，加入二抗后孵育显影检测、分析,重复3次。

2.10 统计分析

3 实验结果

3.1 齐墩果酸对肝癌细胞增殖的影响

空白对照组和齐墩果酸组油剂均为透明微黄的油状液体，将两种乳化剂加水稀释后发现，空白对照组溶液颜色透明并有蓝色乳光，齐墩果酸自微乳水溶液为白色均一液体。空白对照组与模型对照组细胞存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明制备自微乳的辅料对细胞的增殖没有影响。不同剂量的齐墩果酸作用肝癌细胞24 h，细胞存活率与模型对照组相比，具有统计学意义(P<0.05)，随着浓度的增加，细胞的存活率降低，如表1所示。根据细胞增殖实验结果，后续实验齐墩果酸剂量为80 μg·mL-1。

表1 齐墩果酸对肝癌细胞存活率的影响

3.2 齐墩果酸对肝癌细胞IL-6的影响

根据标准曲线公式Y=0.008X+0.143(R2=0.953)，X为IL-6浓度，Y为吸光度，计算各组IL-6的含量(如表2所示)。齐墩果酸和顺铂组IL-6含量均低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与顺铂组相比，齐墩果酸组略低，但无统计学意义(P>0.05)；结果说明，齐墩果酸和顺铂抑制肝癌细胞中IL-6的产生。

表2 齐墩果酸对肝癌细胞IL-6的含量的影响

3.3 荧光显微镜下观察齐墩果酸诱导细胞凋亡

AnnexinV-FITC/PI双标法荧光显微镜观察，其中绿色荧光为AnnexinV-FITC染色阳性细胞，仅被绿色荧光染色为凋亡细胞，未被荧光染色为正常细胞，绿色和红色均染色的细胞为晚期凋亡细胞。图1可见模型对照组细胞正常细胞数量较多，凋亡细胞的数量相对较少。齐墩果酸组和顺铂组凋亡细胞较模型对照组数量明显增加，正常细胞数量相对减少。

图1 荧光显微镜观察肝癌细胞形态(100×)

3.4 流式细胞术检测齐墩果酸诱导细胞凋亡

如表3和图2所示，与模型对照组比较，齐墩果酸和顺铂组的晚期凋亡(Q2)率、早期凋亡(Q4)率和总凋亡率明显增加，差异显著(P<0.05)；齐墩果酸与顺铂组比较，各指标均低于顺铂组，差异显著(P<0.05)。

图2 齐墩果酸对肝癌细胞凋亡的影响

表3 齐墩果酸对肝癌细胞凋亡率的影响

3.5 细胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA表达

各组细胞药物作用24 h后，与模型对照组(2-ΔΔCt=1)相比，用药组Bax mRNA表达明显上调(P<0.05)，顺铂组与齐墩果酸组Bax mRNA差异不显著(P>0.05)；Bcl-2 和Akt mRNA 表达下调(P<0.05)，顺铂组与齐墩果酸组比较差异有统计学意义(P<0.05)，齐墩果酸对Bcl-2 mRNA表达的抑制作用强于顺铂，如表4所示。

表4 齐墩果酸对肝癌细胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA相对表达

3.6 细胞Bax、Bcl-2和Akt蛋白表达

各组细胞Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表达检测结果如图4，表5所示。与模型对照组比较，用药组Bax蛋白表达上调(P<0.05)，顺铂与齐墩果酸比较，有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组相比，用药组Bcl-2蛋白表达下调(P<0.05)，齐墩果酸组低于顺铂(P<0.05)；齐墩果酸和顺铂组Akt和p-Akt蛋白表达下调，与模型对照组相比有统计学意义(P<0.05)；顺铂组Akt和p-Akt蛋白表达低于与齐墩果酸组，有统计学意义(P<0.05)。

图4 齐墩果酸对Bax、Bcl-2、Akt 和p-Akt蛋白表达的影响

表5 齐墩果酸对肝癌细胞Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表达的影响

4 讨论

肝癌属于“癥瘕”“积聚”等范畴，病机为本虚标实，本虚是正气亏虚，标实为气滞、痰浊、湿毒、血瘀相互为患，蕴结于肝致使发病。中医药多以扶正固本、抑癌攻毒为治法，对控制肿瘤发展起重要作用。课题组前期研究的中药女贞子归肝、肾经，属于补益类中药，具有扶正固本作用，并且具有免疫调节作用。女贞子的有效成分齐墩果酸，在本实验中发现通过影响IL-6细胞因子，发挥抗肿瘤作用。IL-6是由淋巴样和非淋巴样细胞产生的细胞因子，对淋巴细胞、造血干细胞、肝细胞等均有生物学效应。IL-6参与肝癌的发生、发展，因此抑制其生成具有重要的意义。IL-6通过激活酪氨酸蛋白激酶-信号传导和转录激活因子(janus kinase-signal transducers and activators of transcription,JAK-STAT)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B,PI3K/Akt)信号通路发挥抑制凋亡的作用[10-12]。齐墩果酸和阳性对照药顺铂均可抑制IL-6产生及Akt基因和蛋白表达，通过抑制该信号通路及其下游基因的表达，诱导细胞凋亡。B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)属于Bcl-2家族成员，彼此相互作用调节细胞的存活与凋亡。Bcl-2和Bax 与线粒体途径的细胞凋亡关系密切。Bcl-2通过调节线粒体膜电位、膜通透性，抑制半胱天冬酶活性，结合细胞色素C，抑制细胞凋亡。Bax接收到各种凋亡信号后，在线粒体膜上形成释放凋亡因子的孔道，促进线粒体膜通透化(MOMP)，细胞色素C释放，启动细胞凋亡。据报道，多种中药和其有效成分可通过调控Bcl-2家族基因的表达，诱导细胞凋亡或自噬，发挥抗肿瘤的作用[13-14]，亦可负调控，避免细胞凋亡性死亡，起到保护细胞的作用[15]。本实验发现齐墩果酸对肝癌细胞有抑制作用，通过上调Bax基因表达，下调Bcl-2基因表达，诱导细胞发生凋亡。齐墩果酸诱导肝癌细胞凋亡率低于顺铂组，下调Akt基因表达作用弱于顺铂，下调Bcl-2基因表达作用强于顺铂，说明药物抗肿瘤的作用靶点多种，顺铂诱导细胞凋亡还有其他的途径和信号通路，各信号通路之间交叉串话，今后课题组将深入研究药物抗肿瘤的其他分子机制。