六君安胃方对化疗相关黏膜炎小鼠小肠干细胞增殖与Wnt/β-catenin通路蛋白表达的干预作用

赵娜，杨宇飞，裴晓华，杨斌，闫韶花，何斌*

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

细胞毒性化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一。化疗药物杀伤癌细胞的同时，损伤机体代谢较快的消化道黏膜，引起化疗相关黏膜炎[1](chemotherapy-induced mucositis,CIM)，累及口腔、胃肠道黏膜，可导致口腔疼痛、恶心呕吐、腹泻等症状[2]。在接受氟尿嘧啶治疗的人群中，胃肠道黏膜炎导致的腹泻发生率高达80%[3-4]，严重影响患者的依从性和化疗期间生活质量[5]。因此对CIM有效干预使患者顺利完成化疗，对恶性肿瘤的抗复发转移治疗有较大的意义。

六君安胃方是中国中医科学院西苑医院肿瘤诊疗部杨宇飞教授的经验方，临床广泛应用于减轻化疗期间消化道副反应，其对结肠癌辅助化疗的协同作用研究已获得2017年国家科技部重大专项中医药现代化研究立项资助。本团队前期门诊病历回顾性分析表明，六君安胃方缓解化疗期间消化道症状的有效率达80%以上。六君安胃方起效的可能机制是通过中医健脾和胃法减轻化疗所致的胃肠黏膜损伤，促进黏膜修复，从而改善临床症状。本研究旨在观察六君安胃方对氟尿嘧啶诱导小鼠化疗相关黏膜炎的防治作用，探索其对小鼠小肠干细胞增殖和Wnt/β-catenin通路蛋白表达的干预作用。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6J雄性小鼠，7～8周龄，体质量18～20 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。动物饲养环境：中国中医科学院西苑医院SPF级动物房，室温24 ℃，相对湿度(60±5)%，12 h白夜交替，自由饮水进食,本实验方案通过本院伦理委员会批准。

1.2 药物

六君安胃方(已申请专利)以太子参、炒白术、陈皮、姜半夏等组成，由中国中医科学院西苑医院药剂科提供。阳性对照药蒙脱石散，浙江海利生制药有限公司，批号：200333；造模药物氟尿嘧啶注射液，天津金耀药业有限公司，批号：2003201。

1.3 试剂及仪器

5-溴-2’-脱氧尿苷(5-Bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)(sigma，货号：B9285);免疫组化一抗Lgr5(abcam，货号：ab219107)，Brdu( proteintech，货号：66241-1-Ig)，Wnt( proteintech，货号：55184-1-AP)，β-Catenin(proteintech，货号：17565-1-AP) 。组织切片机 (Leica RM2235，德国)，显微镜(Olympus BX51，美国)。

2 方法

2.1 分组及造模

60只C57BL/6J雄性小鼠按体质量分层，随机分为正常对照组、模型组、蒙脱石散组、六君安胃高、中、低剂量组，每组10只，适应性饲养1周。参照文献[6-8]及预实验结果制备CIM模型，造模方法为氟尿嘧啶注射液50 mg/kg，腹腔注射，每日1次，连续7 d(第8天至第14天)。小鼠体质量下降伴有腹泻结合镜下小鼠小肠组织病理观察验证造模成功[9]。正常对照组小鼠等量生理盐水腹腔注射，每日1次，连续7 d。

2.2 干预

六君安胃方和蒙脱石散用量根据人-小鼠等效剂量换算[10],具体剂量为中药高剂量组15.66 g/kg、中剂量组为7.83 g/kg、低剂量为3.92 g/kg，灌胃，每日1次；阳性对照蒙脱石散组剂量为1.85 g/kg，灌胃，每日1次；正常对照组与模型组等量无菌水灌胃，连续14 d(第1天至第14天)。小鼠腹腔注射BrdU溶液50 mg/kg，每日1次，连续3 d(第12天至第14天)标记干细胞增殖。第15天断颈处死后取小肠，置入4%多聚甲醛溶液固定24 h。

2.3 体质量、腹泻评分及小肠长度

造模后每天上午9点测小鼠体质量。小鼠体质量变化率计算：(当天体质量-造模前体质量)/造模前体质量×100%。造模后每天上午9时将小鼠抓握后查看大便和肛门周围情况，依据腹泻评估标准确定是否有腹泻及腹泻严重程度[11]，腹泻评估标准如下。0分：大便正常；1分：轻度腹泻(微湿软大便)；2分：中度腹泻(湿大便和不成形大便，肛周被毛中度染色)；3分：重度腹泻(水样大便，肛周被毛重度染色)。计算各组小鼠腹泻评分均值作为比较。第15天断颈处死后分离胃末端至盲肠起始端之间小肠，用卡尺测量小肠长度。

2.4 空肠黏膜形态学

固定后小鼠空肠组织梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片、常规HE染色后在显微镜50倍下观察空肠黏膜结构。在400倍下找到绒毛及隐窝结构，用Image-Pro Plus6.0软件测量绒毛高度和隐窝深度，每个切片选取5个视野，均值表示该小鼠的绒毛高度和隐窝深度。

2.5 小鼠空肠组织免疫组化检测Lgr5+、BrdU+细胞，Wnt、B-catenin蛋白表达

小鼠空肠组织石蜡切片至4μm，脱蜡及水化，3%双氧水避光浸泡10 min封闭，柠檬酸缓冲液高压抗原热修复，一抗孵育(根据预实验选择合适一抗浓度Lgr5 1∶100、BrdU 1∶50、Wnt 1∶100、β-Catenin 1∶200)，4 ℃过夜，二抗孵育30 min，DAB显色，自来水冲洗5 min，苏木素复染细胞核、梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片。显微镜400倍下每切片选取5个视野，用Image-Pro Plus6.0软件测定隐窝结构目标蛋白Lgr5+、BrdU+细胞数和Wnt、B-catenin积分光密度(Integrated Optical Density，IOD)值。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 体质量、腹泻评分及小肠长度

正常对照组小鼠体质量稳定增长，与正常对照组相比，模型组小鼠造模第2天(d9)开始体质量明显下降(P<0.01)，程度日渐严重。与模型组相比六君安胃组小鼠体质量下降程度轻，造模第7天时(d14)高、中剂量组小鼠体质量下降程度显著减轻(P<0.05),见图1。

注：与正常对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。图1 各组小鼠体质量变化

正常对照组小鼠大便正常，模型组小鼠造模第3天(d10)开始腹泻，腹泻评分高(P<0.05),程度逐渐加重。与模型组相比，蒙脱石散组和六君安胃组腹泻程度有减轻趋势，但评分无统计学差异，见图2。与正常对照组相比，模型组小鼠小肠明显缩短(P<0.01)，而六君安胃组小鼠小肠无缩短，较模型有显著差异(P<0.01)，见图3。

注：与正常对照组相比，#P<0.05，##P<0.01。图2 各组小鼠腹泻评分比较

注：与正常对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。图3 各组小鼠小肠长度比较

3.2 空肠黏膜形态学

正常对照组绒毛、隐窝结构清楚、完整，绒毛紧密排列，表面上皮细胞无变性、坏死及脱落，黏膜下层、肌层完整，外膜清晰可见，无炎细胞浸润。与正常对照组相比，模型组绒毛高度缩短、萎缩(P<0.01)，绒毛间距宽，上皮细胞变性、坏死及脱落，腺体轻度减少，黏膜下层充血，炎性细胞浸润，隐窝结构破坏变浅(P<0.01)，肌层平滑肌排列轻度无序，全层厚度变薄。与模型组相比，六君安胃组绒毛高度高(P<0.05)，绒毛间距短，局部表面上皮细胞轻度变性，未见萎缩、坏死、脱落，腺体减少不明显，隐窝破坏较轻，隐窝深(P<0.05)，黏膜下层少量炎性细胞浸润，肌层排列较为规整。其中，高剂量疗效最好，见图4。各组绒毛高度与隐窝深度见表1。

图4 各组小鼠空肠组织形态学(HE染色，×50)

表1 各组小鼠空肠黏膜绒毛、隐窝比较

3.3 隐窝结构Lgr5+、BrdU+细胞及Wnt、β-catenin蛋白表达

正常对照组隐窝结构清晰，Lgr5、BrdU主要表达于隐窝底部，Wnt及β-catenin从隐窝底部到绒毛顶部逐渐递减，本次实验仅观察和统计隐窝结构染色。与正常对照组相比，模型组隐窝结构紊乱，呈弱阳性表达，表达量明显减低(P<0.01)。与模型组相比，六君安胃组表达量增高，且高剂量组疗效最佳。高剂量组的Lgr5+、BrdU+细胞数显著增高(P<0.05);高、中剂量组Wnt、β-catenin蛋白表达量较模型组明显高(P<0.05)，见图5、表2。

图5 各组小鼠空肠黏膜Lgr5、BrdU、Wnt、β-catenin蛋白表达(免疫组化，×200)

表2 各组小鼠空肠黏膜Lgr5+细胞，BrdU+细胞，Wnt、β-catenin蛋白表达

4 讨论

肠道黏膜损伤后的修复依赖于隐窝底部的肠干细胞增殖。肠干细胞经多次分裂后分化为多种不同种类的肠上皮细胞，从隐窝底部向上迁移，以补充更新损伤的上皮细胞。肠干细胞中标志性表达Lgr5的隐窝柱状干细胞，自身保持高度的增殖能力，是肠上皮更新的驱动力[12-15]。本研究中用Lgr5标记隐窝底部肠干细胞，用核苷类似物BrdU，使其与胸腺嘧啶竞争性整合到DNA中，标记干细胞的增殖。免疫组化结果表明，经六君安胃方干预后小肠隐窝结构中Lgr5+和BrdU+细胞数较模型组显著增多；病理形态观察到六君安胃组肠黏膜绒毛高度高、隐窝深，绒毛间距短，局部表面上皮未见萎缩、坏死、脱落，小肠黏膜上皮损伤较轻；体质量下降和小肠缩短程度均较模型组减轻。提示六君安胃方能促进肠干细胞的增殖，进一步促进损伤黏膜上皮的修复，改善小鼠一般情况。而Wnt/β-catenin调控的相关信号通路驱动肠干细胞自我更新和分化，保障肠干细胞增殖和维持[16-17]，是肠道损伤后修复所必须的信号通路[18]。Wnt配体与膜受体结合后抑制β-catenin降解，β-catenin在胞质中聚集并易位到细胞核，与其他转录因子相互作用以激活Wnt靶基因的转录[19]，Wnt的靶基因包括Lgr5、Cyclin D1等，其中Cyclin D1促进细胞增殖，Lgr5使肠干细胞保持其干性[20]。本研究免疫组化结果表明，六君安胃干预后隐窝结构中Wnt蛋白和β-catenin蛋白的表达较模型组显著增高，提示六君安胃方对肠干细胞增殖的作用与其上调Wnt/β-catenin通路的蛋白表达有关。

六君安胃方以《医学正传》中的六君子汤为基础，紧扣化疗期间恶心呕吐、腹胀腹泻为表现的“脾胃不和”病机，加之对化疗这特殊时期易导致气阴两虚的“因时”考虑，太子参易党参，益气养阴；陈皮、姜半夏理气和胃止呕，炒白术、茯苓健脾化湿止泻，全方共奏益气养阴、健脾和胃功效。

本实验的结果表明，六君安胃方能改善CIM小鼠一般情况，减轻小肠黏膜损伤，其可能机制是通过上调Wnt/β-catenin通路蛋白的表达，促进肠道干细胞增殖，从而促进肠上皮损伤的修复。本研究探索了六君安胃方减轻化疗所致胃肠道副反应的机制，但肠道环境复杂，肠道微生物在其中的作用不可忽视。肠道菌群在中药与Wnt/β-catenin通路介导的肠干细胞增殖中起到什么作用需要进一步深入研究。