流感病毒检验及相关方法的研究进展

文 /梁小凤

疾控中心在政府、党的领导下坚持贯彻以预防为主，同时结合防治措施的方针，重视建设检验科实验室，确保可及时有效应对地区出现的疾病与卫生事件，为促进社会发展与地区经济发展做出贡献，疾控中心检验科负责多种流行疾病的病毒、细菌检验等工作，工作任务繁重的同时也面临着严峻挑战[1-2]。流感是严重威胁人类身心健康的疾病类型，而早期进行准确的流感病毒检测可对开展抗病毒治疗工作意义重大，可相对降低流感大流行与季节性流行的发病率与死亡率；目前疾控中心检验科最常见的流感病毒检测方法包括病毒分离、分子检测、免疫学检测等多种[3-4]。本文就流感病毒检验及相关方法的研究进展做一综述报道如下:

1 流感概念

流感是广泛分布于全世界的传染病，在多个国家均存在不同程度的发生率，疾病发病率与死亡率至今仍居高不下，同时流感也对多种家禽、家畜、珍稀野生动物生命安全造成威胁，极大影响了各国经济发展[5]。流感病毒在病毒分类学上属于正黏病毒科，包括8个大小不等的独立单股负链RNA片段共同组成，共编码10个蛋白，根据基质蛋白、核蛋白的不同又可将流感病毒划分为4属，其中甲型流感病毒可根据不同的神经氨酸酶抗原性与病毒粒子的血凝素划分为不同亚型[6]。甲型流感病毒传播途径以呼吸道飞沫传播为主，可在短时间内迅速传播，具有较短的潜伏期，可感染人、家禽、哺乳动物等，曾经多次引发世界性的大流行。而乙型与丙型流感病毒的感染对象仅为人类，其中乙型流感流行多为局限性，而丙型流感则不会引发严重的疾病，多呈现散发出现[7]。我国为流感高发区域，也是流感病毒易发生变异的主要地区之一，近年来频频发生大流行的流感，更是会直接威胁人类生命安全，因此疾控中心检验科建立更加便捷、快速、准确的检测方法对诊治流感意义重大。

2 分子检测技术

近年来关于研究分子生物学的技术获得长足发展进步，关于流感病毒的检测技术也更加多样化、丰富化、成熟化，除了纳米技术、质谱法、基因测序法等外，本文中主要介绍核酸序列依赖性扩增、聚合酶链反应检测、环介导的等温扩增技术等，目前我国预防、监测流感病毒最广泛应用的方法即为聚合酶链反应检测法[8]。

2.1 聚合酶链反应(PCR)

通过分子生物学检测技术实现经PCR检测流感病毒，技术原理指在较短时间内添加大量特异性DNA片段完成病毒检测，具体检测过程中仅需要少量样品即可完成检测工作，且具有速度快捷、可重复操作、高效灵敏的特点，从收集样本至获得最终的检测结果最少需要花费2h，最多需要花费24h。PCR方法包括实时荧光定量方法、RT-PCR方法、多重RT-PCR方法[9]。其中RTPCR方法包括检测HA基因片段、NA基因片段，目前检测未知流感，通过合并引物扩增病毒的基因片段完成分型。多重RTPCR方法每次可检测1种病毒，也可检测多种病毒，但必须通过多对引物组合完成类型检测，具有灵敏度高等特点。实时荧光定量检测法指在PCR反应系统中添加荧光信号，完成定量分析，具有普通PCR法的高灵敏度、较强的特异性、可重复操作等优势，同时可更加直观的检测荧光因子，可有效降低检测假阳性可能性。

2.2 环介导等温扩增法(LAMP)

环介导等温扩增法是指在恒定温度下将DNA聚合酶与四种特异性引物完成置换，以实现在靶基因上多区域的核酸扩增，该检测法无须特殊仪器、试剂，具有操作步骤简单等优势。LAMP检测包括无扩增、扩增2个结果，仅需要根据试剂浊度、反应物颜色即可对结果进行判断。目前LAMP技术在疾控中心实验室运用成熟，且开发了多种针对性检测技术，如H3N2病毒的检测技术、新型H1N1流感病毒检测技术、季节性流感病毒的检测技术[10]。

2.3 依赖核酸序列的扩增法(NASBA)

NASBA的特异性与检测敏感性均高于PCR检测法，且扩增效率更高、同时操作步骤也相对简单，但该方法检验过程中需要优化引物，也存在部分病毒检测出假阳性、敏感性不足的情况；NASBA主要对一对引物引导连续的特异性单链RNA进行恒定温度扩增以产生反应[11]。

3 病毒的分离与鉴定

传统多采取病毒分离法检测病毒，包括细胞培养、鸡胚接种，检测过程指采取检测样液选择适宜的犬肾细胞或鸡胚细胞进行病毒分离，获得新的病毒毒株，但该方法具有一定局限性，如分离周期时间长、操作步骤烦琐等，如鸡胚接种为例，传3代病毒需要花费2周左右时间，病毒分离后还需要采取其他方法进行鉴定[12]。目前多采取犬肾与鸡胚细胞2套系统培养病毒阳性病变后再进行免疫荧光技术鉴定，排除其他病毒后可检测甲型流感病毒的核蛋白，确定病毒为禽流感病毒后再鉴定亚型，进行确诊，但该方法无法被应用于快速检测大量样本，此外也存在较大的安全隐患，因此无法大规模应用。

4 免疫学检测

4.1 琼脂凝胶扩散试验

甲型流感病毒的核蛋白是主要的琼脂免疫扩散抗原，由抗体扩散可形成沉淀线可检测感染流感病毒后产生的血清抗体，操作步骤简单，但获取结果时间相对较长，需要24h，且特异性与敏感性均较酶联免疫吸附试验、血凝抑制试验低，还需要通过大量的抗原抗体才可能产生沉淀线。

4.2 神经氨酸酶抑制试验

鉴定甲型流感病毒表面抗原神经氨酸酶亚型(N1-N9)多采取神经氨酸酶抑制试验，有研究改进常规神经氨酸酶抑制试验方法，建立平板微量试验方法，可减少抗原用量，同时完成多种分离物的抗原分类，可作为检测抗体、病毒分类的快速测定，世界卫生组织认为神经氨酸酶亚型分类推荐应用该检测方法。

4.3 血凝集血凝抑制试验

该检测方法的应用优势包括操作简单、方便易行、在诊断流感的血清学诊断中发挥一定价值，但敏感性差，无法检出病毒最新的血凝素亚型，且需要预处理血清，操作步骤耗时长，不利于早期诊治流感，主要用于检测流感病毒血清学的辅助措施。目前国际上普遍使用微量血凝抑制法，该方法可确定病毒亚型，易出现非特异性凝集，但同时因操作不同也会存在较大偏差。

4.4 酶联免疫吸附试验

因酶具有较高的催化频率，可在较大程度上放大反应，提高测定结果的灵敏度，检测抗原与抗体可运用不同的酶联免疫吸附试验，应用优势包括快速、操作方便、灵敏性高、特异性强等，适合快速诊断流感疑似病例，是当前应用范围较广的免疫测定方法。

5 小结

流感是一种在全球内广泛流行分布的传染病类型，在我国历史上也发生过多次大流行的流感现象，威胁城镇居民生命安全，对国家社会安定、经济发展均造成负性影响，至今人类已经研究出多种流感病毒的检测方法，但每种方法均存在一定的优势与劣势，总体而言，传统检测方法具有较高的准确度，但检测操作过程复杂繁琐、费时费力；而免疫学检测方法可迅速获得检测结果，且操作步骤简单，对操作人员与仪器要求均不高，较适宜大规模的普及；酶联免疫方法具有快速、可定量、较高的灵敏度。