高效液相色谱法同时测定黑蒜中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸及γ-谷氨酰半胱氨酸含量

卢连登，周 御，黄振荣，刘春凤，郑飞云，钮成拓，王金晶，马玉金，李 崎，王 栋*

(1.江南大学教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；2.青海恩露生物科技有限公司，青海 海东 810700)

黑蒜又名黑大蒜，是用新鲜生蒜，带皮放在高温高湿环境自然培养一段时间制成的产品，由于培养后蒜瓣呈黑色，因此称为黑蒜。黑蒜去除大蒜异味，带有甜味、口感好，无需再处理即可直接食用，与白大蒜相比，营养更加丰富、生物活性增强、应用前景广阔[1]。黑蒜具有消除疲劳、增强抗氧化性、保肝护肝、促进睡眠、降血压血脂、降胆固醇、抗糖尿病、抗肿瘤等功能[2]。黑蒜在去除大蒜刺激性气味同时，适当保留具有生物活性含硫化合物[3]，多酚样物质含量增加，抗氧化能力显著增强，营养价值更高[2,4]。

在黑蒜多种含硫有机化合物中，蒜氨酸及其主要相关硫化物被视为黑蒜主要功效成分，主要包括脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸[5]。现代药理学研究表明，蒜中蒜氨酸（Alliin）具有多种药理活性，如抑菌作用、抗肿瘤作用、促进肝脏代谢、免疫调节、预防心肌损伤、降血糖血脂、抗氧化作用，还有助于口腔健康[6]。脱氧蒜氨酸是蒜中重要含硫化合物，与蒜抗氧化、抗癌和有益神经活性功能有关[7]，脱氧蒜氨酸形成与蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸有关[8]。γ-谷氨酰半胱氨酸，是蒜氨酸重要前体物质，具有抗氧化作用[9]。脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸与黑蒜中蒜氨酸转化联系密切，选用蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸作为黑蒜中指标成分评价和控制大蒜质量更为合理。

目前，蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量测定方法多为定硫法[10]、薄层色谱扫描法[11]、HPLC 法[12]或HPLC-MS/MS法[5]，但定硫法准确度较低，薄层色谱扫描法是半定量方法，在特定条件下使用，HPLC-MS/MS法设备昂贵，成本较高，至今未有关于这3种成分同时检测报道。本文采用HPLC法同时检测黑蒜中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸，此方法操作简便，分析迅速，回收率高，准确灵敏，线性范围广。研究旨在为后续深入研究黑蒜生产过程中质量控制提供理论基础和数据参考，为黑蒜质量评价提供有效检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒜氨酸标准品、脱氧蒜氨酸标准品、γ-谷氨酰半胱氨酸标准品均购自Sigma-Aldrich公司；甲醇（色谱纯）购自麦克林公司；磷酸（分析纯）购自购自国药化学试剂有限公司；超纯水；市售黑蒜。

1.2 仪器与设备

日立CM5110高效液相色谱仪（日本日立公司）；PL-2000电子天平（METTLER TOLEDO公司）；JYL-C022E型料理机（九阳股份有限公司）；5804R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；超声提取器；GZX-9746MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；SHZ-B型数显恒温水浴振荡器（上海博讯实业有限公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 样品溶液制备

准确称取黑蒜样品10.0000 g，准确加入100 mL 10%甲醇，榨汁机粉碎至样品呈稀糊状，室温下超声（强度70%）15 min后，双层滤纸过滤，取澄清滤液于离心管内，8 000 r·min-1转速下离心15 min，上清液定容至250 mL容量瓶中，用提取液定容至刻度，过0.22 μm滤膜后备用。

1.3.2 对照品溶液制备

分别精密称取蒜氨酸34.0 mg，脱氧蒜氨酸70.0 mg，γ-氨酰半胱氨酸46.0 mg，超纯水分别溶解并定容于50 mL容量瓶中，摇匀制得蒜氨酸母液，脱氧蒜氨酸母液和γ-谷氨酰半胱氨酸母液；分别精密吸取 680.00 μg·mL-1蒜氨酸溶液 2 mL、1 400 μg·mL-1脱氧蒜氨酸溶液1 mL和920 μg·mL-1γ-谷氨酰半胱氨酸溶液2 mL于5 mL离心管中，混匀，即得混合对照品母液，此时蒜氨酸浓度为272 μg·mL-1，脱氧蒜氨酸浓度为280 μg·mL-1，γ-谷氨酰半胱氨酸浓度为368 μg·mL-1。4℃保存备用。

1.3.3 HPLC色谱条件

色谱柱:ZORBAX-Eclipse XDB-C18Analytical柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流速:0.8 mL·min-1；柱温:30℃；进样量:20 μL；以V（甲醇）∶V（0.1%磷酸水溶液）=10∶90为流动相；检测波长:220 nm。

1.3.4 蒜氨酸、脱氧蒜氨酸及γ-谷氨酰半胱氨酸含量计算

将制备混合对照品母液配制成不同浓度梯度混合对照品溶液并进样，以蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸对照品不同浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并得到相应线性回归方程。将处理后样品溶液作HPLC分析，进样量为20 μL，测出对应峰面积Asample，将峰面积代入线性回归方程，得到对应物质浓度Csample，依据黑蒜水分含量ω（%），计算黑蒜中蒜氨酸及其硫化物绝干物质含量（mg·g-1）。以蒜氨酸为例，计算过程如式（1）所示。

式中，N—蒜氨酸绝干物质含量（mg·g-1）；M—黑蒜样品中蒜氨酸湿重（μg·g-1）；W—黑蒜含水量（g·100 g-1）。

1.4 试验方法

1.4.1 样品预处理方法

提取溶剂:选择料液比1∶10，提取方式为超声，提取时间20 min，提取温度30℃，研究不同溶剂对提取液中蒜氨酸及其相关硫化物含量影响。3种提取溶剂为:超纯水、10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液。

料液比:选择提取溶剂为10%甲醇，超声提取时间20 min，提取温度30℃，利用HPLC方法测定料液比分别为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25时，提取液中蒜氨酸及其相关硫化物含量。

提取方式:选择提取溶剂为10%甲醇，料液比1∶10，提取时间20 min，提取温度30℃，分别研究超声、振荡和静置3种提取方式。设定超声波功率为300 W；水浴振荡器振荡频率为120 r·min-1。利用HPLC方法测定不同提取方式下液中蒜氨酸及其相关硫化物含量情况。

提取时间:选择提取溶剂为10%甲醇，料液比为1∶10，提取方式为超声，提取温度30℃，研究提取时间10、15、20、25、30 min时，提取液中蒜氨酸及其相关硫化物含量。

1.4.2 流动相及洗脱方式选择

1.4.2.1 流动相选择

比较超纯水、10%甲醇+0.1%磷酸、0.1%磷酸、10%甲醇和20%甲醇分别作为流动相，等梯度洗脱，对黑蒜中蒜氨酸及其相关硫化物含量分析结果影响。流速0.8 mL·min-1，进样量20 μL，检测波长220 nm。

1.4.2.2 洗脱方式选择

以流动相A（甲醇）和流动相B（0.1%磷酸）为流动相，比较梯度洗脱和等度洗脱两种方法对黑蒜中蒜氨酸及其相关硫化物含量分析结果影响，洗脱条件分别设置如下:

洗 脱 条 件 1:0～15 min， 0～15 min10%A+90%B；

洗脱条件2:0～3 min，5%A+95%B；3～5 min，10%A+90%B；5～15 min，15%A+85%B；

洗脱条件 3:0～3 min，10%A+90%B；3～5 min，15%A+85%B，5～15 min，20%A+80%B；

洗 脱 条 件 4:0～3 min， 100%B； 3～5 min，10%A+90%B；5～15 min，20%A+80%B。

1.4.3 检测波长确定

取1.3.2中制备混合对照品溶液，按照1.3.3中色谱条件进样，分别考查220、250、280、300 nm不同波长下蒜氨酸及其相关硫化物含量分析结果差异，确定最佳检测波长。

1.4.4 方法有效性测定

精密吸取1.3.2项下制备对照品储备液适量，配制蒜氨酸质量浓度分别为272.00、217.60、163.20、108.80、54.40、27.20 μg·mL-1，脱氧蒜氨酸质量浓度分别为280.00、224.00、134.40、89.60 、44.80、22.40 μg·mL-1，γ-谷氨酰半胱氨酸质量浓度分别为368.00、294.40、220.80、147.20、73.60、36.80 μg·mL-1。取上述标准溶液20 μL作色谱分析，记录峰面积，分别以不同化合物质量浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标作线性回归分析，计算得回归方程。

检出限:在高效液相色谱仪上采集一段基线，选取一段稳定波动，计算最高点和最低点之间高度，作为仪器噪音，分析待测样品进样，当信噪比S/N=3时，此时浓度即为检出限。

精密度和回收率:平行制备5份黑蒜样品溶液，按1.3.3中色谱条件进样测定含量，重复测定5次，研究方法精密度；另3份各添加500、1 000、1 500 μg·g-1标准物质，研究不同添加量下物质加标回收率。

2 结果与分析

2.1 样品预处理和检测条件选择

2.1.1 样品预处理条件确定

2.1.1.1 提取溶剂

不同提取溶剂对黑蒜中蒜氨酸及硫化物提取后检测结果如图1所示。

由图1可知，不同提取溶剂对蒜氨酸和脱氧蒜氨酸提取无明显影响，蒜氨酸和脱氧蒜氨酸在不同提取液中含量分别稳定在3.3和8.7 mg·g-1；相比之下，10%甲醇提取液对γ-谷氨酰半胱氨酸提取效果较好，此提取液中γ-谷氨酰半胱氨酸含量达到28.23 mg·g-1，分别较超纯水和20%甲醇体系中含量提高5.4%和13.3%；因此后续选择10%甲醇作为蒜氨酸及其硫化物提取溶剂。

2.1.1.2 料液比

选择10%甲醇作为提取溶剂，不同料液比条件下对黑蒜中蒜氨酸及硫化物提取检测结果如图2所示。

由图2可知，随料液比增大，蒜氨酸和脱氧蒜氨酸含量无明显差异，蒜氨酸和脱氧蒜氨酸在不同料液比下分别稳定在3.1和8.3 mg·g-1；γ-谷氨酰半胱氨酸含量呈先增后降趋势，因为随料液比增大，渗透体系浓度差增大，渗透速度加快，即黑蒜中蒜氨酸及其相关硫化物溶出速度加快，而料液比过大，溶液浓度减小，影响提取溶剂对物料吸收，从而使蒜氨酸及其硫化物溶出减少。当料液比为1∶10时，γ-谷氨酰半胱氨酸含量最高，达28.23 mg·g-1。因此后续研究选取料液比为1∶10作黑蒜中蒜氨酸及其硫化物提取操作。

2.1.1.3 提取方式

不同提取方式下黑蒜样品中蒜氨酸及硫化物提取结果如图3所示。

由图3可知，不同种提取方式对蒜氨酸提取效率有显著影响，静置提取时由于蒜氨酸等硫化物溶出不充分，提取率较低，蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量分别为1.95、7.96、22.65 mg·g-1；振荡提取与静置提取相比，较静置条件下有所提高，蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量分别为2.54、8.08、26.34 mg·g-1，较静置条件分别提高30.3%、1.5%、16.3%；超声方式提取蒜氨酸及其硫化物效率相对较高，在超声条件下，蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量分别为3.6、8.9、28.2 mg·g-1，较静置条件分别提高86.1%、12.7%、24.6%，因此后续选择超声作为蒜氨酸及其硫化物提取方式。

2.1.1.4 提取时间

不同提取方式下黑蒜样品中蒜氨酸及硫化物提取结果如图4所示。

由图4可知，在试验范围内，黑蒜中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量随提取时间变化趋势均为先增后降，20 min时达到峰值，分别为3.63、8.97、28.23 mg·g-1。在小于或大于20 min时，蒜氨酸及其相关硫化物含量降低，小于20 min时，由于提取时间较短，蒜氨酸及其相关硫化物溶解不充分，当时间大于20 min时，溶解蒜氨酸及其相关硫化物有部分损失，所以确定提取时间为20 min。

综上所述，黑蒜蒜氨酸及其硫化物较理想提取条件确定为:提取溶剂10%甲醇，料液比1:10，提取温度30℃，超声提取20 min。

2.1.2 流动相及洗脱方式选择

2.1.2.1 流动相选择

比较超纯水、10%甲醇+0.1%磷酸、0.1%磷酸、10%甲醇和20%甲醇分别作为流动相，作等度洗脱，最终确定10%甲醇+0.1%磷酸为流动相。

在等度洗脱条件下，流动相为10%甲醇+0.1%磷酸时，蒜氨酸、脱氧蒜氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸目标峰分离度最好，分别为1.612、2.500、4.602，均大于1.5，3种组分分离情况良好，出峰时间适宜，峰形好；流动相为超纯水时，3个目标峰分离度均小于1.5，分离情况较差，峰形较宽；流动相为0.1%磷酸时，蒜氨酸和脱氧蒜氨酸分离情况较好，分离度分别为1.667、2.444，均大于1.5，γ-谷氨酰半胱氨酸分离情况较差，分离度为1.143，小于1.5；流动相为10%甲醇时，脱氧蒜氨酸分离情况较好，分离度为3.167，大于1.5，蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸分离情况较差，分离度分别为0.978、0.857，均小于1.0；流动相为20%甲醇时，脱氧蒜氨酸和蒜氨酸分离情况较好，分离度分别为1.792、1.556，大于1.5，γ-谷氨酰半胱氨酸分离情况较差，分离度为1.412，小于1.5。因此，选择10%甲醇+0.1%磷酸作为流动相，进一步比较在该流动相条件下，梯度洗脱和等度洗脱对检测效果影响。

2.1.2.2 洗脱方式选择

以10%甲醇+0.1%磷酸为流动相，比较梯度洗脱和等度洗脱两种方法影响，洗脱条件1:0～15 min，0～15 min10%A+90%B；洗脱条件 2:0～3 min，5%A+95%B；3～5 min，10%A+90%B；5～15 min，15%A+85%B；洗脱条件3:0～3 min，10%A+90%B；3～5 min，15%A+85%B，5～15 min，20%A+80%B；洗脱条件 4:0～3 min，100%B；3～5 min，10%A+90%B；5～15 min，20%A+80%B；其中，A为甲醇，B为0.1%磷酸水溶液。

选用10%甲醇+0.1%磷酸等度洗脱，蒜氨酸、脱氧蒜氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸保留时间分别为3.447，5.647和2.733 min，通过比较发现此方法出峰时间适宜、峰形好，测定3个成分峰之间分离情况最好。

2.1.3 检测波长

制备混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，结果表明，3种待测成分分离度均＞1.5，但3种成分最大吸收波长相差较大，蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸最大吸收波长分别为220、250和300 nm，为兼顾3个化合物检测灵敏度及甲醇末端吸收，选择检测波长为220 nm。

2.2 方法有效性

线性关系和检出限测定结果见表1。由表1可知，蒜氨酸在27.20～275.00 μg·mL-1呈良好线性关系；脱氧蒜氨酸在22.40～280.00 μg·mL-1线性关系良好；γ-谷氨酰半胱氨酸在36.80～368.00 μg·mL-1线性关系良好。R2分别为0.9992，0.9991和0.9988；当信噪比S∶N=3时，蒜氨酸，脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸最低检出限分别为0.17、0.12 和0.31 μg·mL-1。精密度均≤2.87%，表明精密度良好。方法回收率结果见表2。

表1 标准曲线线性参数Table 1 Lnear parameters of standard curves

表2 回收率试验结果Table 2 Results of recovery

本方法蒜氨酸回收率均≥92.80%，脱氧蒜氨酸回收率均≥95.47%，γ-谷氨酰半胱氨酸回收率均≥92.00%，3种成分RSD均≤2.35%，表明回收率较高，测定结果准确。

2.3 黑蒜样品测定

依照2.1.1较优提取条件对市售黑蒜共7个样品及原料蒜1个样品作提取，在上述色谱条件下测定样品中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量，标准样品和典型黑蒜样品中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸测定高效液相色谱图分别如图5所示。每个样品平行测定3次，计算平均值，结果见表3，样品编号1～7为市售黑蒜，编号8为原料蒜。可知，γ-谷氨酰半胱氨酸、蒜氨酸、脱氧蒜氨酸3种成分出峰时间分别为:2.733、3.447、5.647 min。各物质在10 min内均可达到完全分离，各成分分离度高，峰型好。表明该方法适合同时检测分析黑蒜中γ-谷氨酰半胱氨酸、蒜氨酸、脱氧蒜氨酸含量。

表3 样品含量测定结果Table 3 Results of determination of the sample content(n=3)(mg·g-1)

由表3可知，在市售黑蒜样品中均检测出蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸，其中5号市售黑蒜产品蒜氨酸含量最高，7号市售黑蒜产品蒜氨酸含量最低；1号市售黑蒜产品脱氧蒜氨酸含量最高，6号市售黑蒜产品脱氧蒜氨酸含量最低；7号市售黑蒜产品γ-谷氨酰半胱氨酸含量最高，3号市售黑蒜产品γ-谷氨酰半胱氨酸含量最低。在1号、2号、3号、4号和7号市售黑蒜中，蒜氨酸含量均低于其他两种硫化物；在5号和6号市售黑蒜中，脱氧蒜氨酸含量均低于其他两种硫化物；在7种市售黑蒜中，γ-谷氨酰半胱氨酸含量均高于其他两种硫化物；8号原料蒜中，蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量接近，脱氧蒜氨酸含量最少，且相比于7种市售黑蒜，原料蒜中蒜氨酸含量均高于市售黑蒜，脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量均低于市售黑蒜。以上黑蒜中3种硫化物组分差异为生产工艺或原料不同所致，因原料蒜与黑蒜中3种硫化物组分较大差异，后续将进一步探究黑蒜生产过程中蒜氨酸及其硫化物变化。

3 讨论与结论

本研究建立同时检测黑蒜中蒜氨酸及其相关硫化物含量变化高效液相色谱方法。蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸浓度分别在27.20～275.00、22.40～280.00、36.80～368.00 μg·mL-1下线性关系良好，相关系数R2在0.9988～0.9992，检出限分别为0.17、0.12和0.31 μg·mL-1。本方法蒜氨酸回收率均≥92.80%，脱氧蒜氨酸回收率均≥95.47%，γ-谷氨酰半胱氨酸回收率均≥92.00%，回收率较高。本方法简便快速、分离效果好、灵敏度高、针对性强，可满足黑蒜中蒜氨酸及其含硫化合物定性、定量检测需求。

利用本研究建立黑蒜中蒜氨酸及其相关硫化物含量测定方法，可检测和分析黑蒜生产过程中蒜氨酸及其相关硫化物，为后续深入研究黑蒜生产过程中质量控制提供相应理论基础和数据参考，并为黑蒜相关食品、药品和保健品行业筛选优质黑蒜提供可行评价方法，对延长黑蒜产业链、推动黑蒜产业可持续发展具有重要意义。