HBV感染的肝细胞癌患者血清高尔基体蛋白73与IL-18水平及其对肝动脉化疗栓塞术的影响

徐 永，宁国龙，胡宗举，汤 磊

0 引 言

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)指起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的消化系统常见恶性肿瘤，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占90%以上[1]。对于无法接受根治手术的HCC患者，临床常采用肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)治疗[1]；但TACE术后易出现疾病进展，严重影响患者治疗效果及生存状况。如何早期预测并指导临床干预是关键[2]。HBV感染可引起反复肝细胞损伤，是当前公认与肝癌发病关联密切的因素；且有研究认为，积极抗HBV治疗可降低TACE术后复发转移风险[3]。实际中HBV感染并不能解释全部的肝癌发病或TACE术后疾病进展，寻找与肝癌生物学特征关联密切的敏感生物标志物以评估患者预后是当前研究热点之一[4]。高尔基体蛋白73(Golgi protein 73，GP73)是主要表达于结肠、前列腺等组织上皮细胞的一种新的高尔基膜蛋白。其在正常肝细胞中呈低表达或不表达状态，但当包括病毒感染在内的多种原因所致肝损伤时，GP73可在肝组织中大量表达并释放入血[5]。白细胞介素-18(IL-18)是一种主要由免疫细胞分泌的前炎性因子，具有广泛生物学功能。近年来有研究认为，IL-18可参与很多疾病免疫性病理损害过程，且在多种肿瘤发生发展占重要地位[6]。本研究以HCC患者为研究对象，通过检测血清GP73、IL-18表达，并分析两者与患者HBV感染及TACE术后疾病进展关系，旨在为临床HCC预后评估及干预提供支持。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性分析2016年1月-2019年7月于本院确诊并接受治疗的107例HCC患者临床资料。纳入标准：符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》中HCC诊断标准[7]；均接受TACE治疗；入院前未接受抗HBV治疗、放化疗、靶向治疗、手术治疗；年龄>18岁；肝功能Child-Pugh分级A～B级；精神、认知良好；取得随访配合。排除标准：肝癌复发患者；合并肝脓肿血管瘤、肝性脑病；存在其他部位恶性肿瘤；合并重要器官功能不全、凝血功能障碍、免疫系统疾病、神经系统疾病；预期生存时间<3个月；治疗依从性差；无法获得随访配合。107例患者中，男71例，女36例，年龄28～73岁，平均(49.59±9.08)岁。参照HBV感染诊断标准《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》将纳入研究患者分为感染组65例、非感染组42例[8]。

1.2研究方法

1.2.1 血清指标检测采集患者入院后第2天清晨空腹肘静脉血5 mL，以3000 r/min转速离心5min，留取上清液于EP管，-80 ℃条件下保存备用；选择BIO-RAD公司伯乐-550型全自动酶标仪，采用酶联免疫吸附试验法检测血清甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、GP73、IL-18水平，试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司，检测步骤严格按试剂盒操作。

1.2.2HBV-DNA载量检测采集清晨空腹肘静脉血5 mL，分离血清后分装于EP管，于-4 ℃下保存备用，于1周内完成HBV-DNA载量检测；先采用磁珠吸附法提取血清HBV-DNA，DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；选择HBV基因组相对保守区为靶目标，设计特异性引物(引物序列5′-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3′、5′-ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3′)及荧光探针(序列为5′-TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG-3′)；以实时荧光定量PCR法(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)法检测HBV-DNA滴度，采用美国ABI公司7000型DNA扩增仪，HBV核酸定量检测试剂盒购自艾康生物技术(杭州)有限公司；PCR扩增反应条件：37 ℃ UNG酶反应3 min，93 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，55 ℃退火1 min，共35个循环，35 ℃冷却10 s。DNA扩增仪收集反应信息，计算机自动计算定量结果，读取待测样本HBV-DNA拷贝数，HBV-DNA>1.0×103copies/mL为阳性。

1.2.3随访TACE术后结合患者情况，每1～2个月复查CT或MRI，参照实体瘤疗效标准[9]。了解患者疾病进展情况，其中基线病灶长径总和增加20%，或见1个或多个新病灶视为疾病进展；每3个月进行1次门诊随访，统计患者2年内无进展生存情况。

1.3观察指标比较感染组与非感染组血清AFP、GP73、IL-18水平，并进一步根据患者血清GP73、IL-18水平将患者分为GP73高表达组、GP73低表达组以及IL-18高表达组、IL-18低表达组；分析感染组患者血清AFP、GP73、IL-18水平与HBV-DNA载量关系；随访2年，统计患者TACE术后无进展生存情况，并分析其影响因素。

2 结 果

2.1 感染组与非感染组一般资料比较感染组与非感染组患者性别、年龄、体重指数、肿瘤直径、分化程度、Child-Pugh分级比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表 1 感染组与非感染组一般资料比较

2.2感染组与非感染组血清AFP、GP73、IL-18水平比较感染组患者血清GP73、IL-18水平均显著高于非感染组(P<0.05)；但两组患者血清AFP水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表 2 感染组与非感染组血清AFP、GP73、IL-18水平比较

2.3感染组患者血清AFP、GP73、IL-18水平与HBV-DNA载量相关性感染组患者血清GP73、IL-18均与HBV-DNA载量呈正相关(r=0.665、r=0.548，P<0.05)，且GP73与IL-18呈正相关(r=0.314，P<0.05)；AFP与血清GP73、IL-18及HBV-DNA载量之间均无显著相关性(P>0.05)。

2.4患者TACE术后2年内疾病进展情况及Cox回归分析结果107例患者均获得随访资料，随访时间4～24个月，共84例患者发生疾病进展，无进展生存率21.50%(23/107)，中位无进展生存期10个月。COX回归分析显示，HBV感染、分化程度、GP73、IL-18是影响患者TACE术后无进展生存期的危险因素(P<0.05)。见表3。

表 3 影响患者TACE术后无进展生存期的COX回归分析

2.5血清GP73、IL-18水平对TACE术后复发转移预测价值非HBV感染组TACE术后2年无进展生存率高于感染组(Log Rankχ2=26.106，P<0.001)；GP73低表达组高于高表达组(Log Rankχ2=24.584，P<0.001)，IL-18低表达组高于高表达组(Log Rankχ2=41.309，P<0.001)。见图1-图3。

图 1 HBV感染与否患者TACE术后无进展生存函数

图 2 血清GP73不同表达水平患者TACE术后无进展生存函数

图 3 血清IL-18不同表达水平患者TACE术后无进展生存函数

3 讨 论

据文献显示，全球范围内每年肝癌发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居第3位，其中我国每年肝癌发病例数占全球总数50%以上，且近年来仍有上升趋势[10]。HCC具有恶性程度高、预后差特点，外科手术、肝移植是当前治愈HCC的唯一可能方案，但由于HCC早期症状不典型，多数患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳手术根治时机，TACE已成为延长HCC患者生存期的重要治疗方法[11]。但TACE术后患者仍面临着疾病进展困扰，如何早期预测疾病进展并针对性干预是关键[12]。

3.1HBV感染影响TACE术后疾病进展HBV作为引起传染性肝病常见病毒，已被研究证实与肝癌发生发展关联密切，有文献显示，52%左右肝癌与HBV感染有关[13]。目前关于HBV感染与肝癌关联机制有一定研究，但仍有许多不清晰地方，一般认为可能涉及以下几点[14]。①HBV感染后，病毒DNA可整合到肝细胞DNA，使得肝细胞DNA受损及功能障碍，造成肝细胞染色体不稳定，诱导肝细胞癌变；②HBV感染可能引起基因插入突变，激活原癌基因，使得肝细胞恶性转化；③HBV感染通过表达多种病毒蛋白如HBx蛋白调控癌基因，影响肝细胞增殖活性，进而诱导肝癌进展。本研究中107例HCC患者，其中65例(60.75%)合并HBV感染，且HBV感染是患者TACE术后无进展生存期的影响因素，提示在HCC患者诊疗过程中，应重视HBV检测及治疗。

3.2血清GP73、IL-18水平与HBV感染呈正相关GP73蛋白是相对分子量为73 000Da的高尔基体Ⅱ型跨膜蛋白，其表达与高尔基体结构完整性相关。研究发现，GP73主要表达于肝胆管上皮细胞；而在正常肝细胞中不表达或低表达。当各种原因引起肝细胞损伤时，肝细胞高尔基体结构发生变化，GP73分泌可明显升高，因此GP73在各种肝炎、肝硬化及肝癌组织中表达明显增加[15]。本文研究显示，GP73在肝癌合并HBV感染患者血清表达水平较非HBV感染者进一步升高，且与HBV-DNA载量呈正相关，提示HBV感染可能导致GP73分泌增加。既往研究指出，多种细胞因子如干扰素-γ、白介素-6等可引起肝细胞GP73表达上调，慢性HBV感染可能通过介导相关免疫炎性损伤，引起大量炎性细胞因子表达，进而促进GP73表达[16]；血清GP73水平与HBV感染者肝炎症损伤、肝纤维化进程及肝功能均有相关性[17]；上述研究支持本研究结果。IL-18是主要由巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞分泌的Th1型细胞因子，可参与机体免疫调节，研究指出，IL-18与包括肝炎在内的多种疾病免疫性病理损害有关[18]。在机体肿瘤免疫环境中，IL-18可通过诱导T细胞、自然杀伤细胞等活化提高机体对肿瘤细胞杀伤活性，还可以通过抑制血管生成来控制肿瘤生长，IL-18表达上调能反映出机体对肿瘤增生的高免疫状态，但其表达过高也可引起肿瘤免疫逃逸，因此对患者并无益处[19]。本研究发现，合并HBV感染的患者血清IL-18表达进一步升高，且与HBV-DNA载量呈正相关，提示HBV感染可能引起IL-18高表达。既往文献指出，HBV感染可通过激活肝脏枯否细胞，使得IL-18表达增加，而且相关病毒蛋白HBx蛋白可上调IL-18基因表达，引起IL-18表达升高[20]；支持本研究结果。

3.3血清GP73、IL-18水平影响TACE术后疾病进展TACE术是当前治疗HCC最主要的非根治性方案，其原理在于通过栓塞剂阻塞肝动脉，并注入高浓度化疗药物，从而导致肿瘤组织缺血、坏死，达到促进肿瘤细胞坏死、抑制肿瘤生长目的，但患者TACE术后容易因复发转移影响治疗效果[21]。本研究显示，107例患者随访2年内，无进展生存率仅21.50%，提示TACE术后无进展生存情况较差。本研究经COX回归分析发现，低分化、合并HBV感染是TACE术后无进展生存期的影响因素，可能因为低分化意味着患者恶性程度高，而合并HBV感染意味着患者存在反复肝损伤风险，这与既往报道一致[22]。本研究还显示，血清GP73、IL-18也是患者TACE术后无进展生存的影响因素，且均表现为高表达组无进展生存率较低表达组下降，但具体影响机制本研究并未探讨。既往有研究指出，GP73可通过调控肿瘤相关巨噬细胞来促进肝癌进展[23]；而IL-18可通过调节基质金属蛋白酶来促进肝癌转移、迁徙[24]；上述研究均提示GP73、IL-18高表达可能通过某些免疫炎症信号通路来促进肝癌进展。

综上所述，血清GP73、IL-18在HCC合并HBV感染患者中表达上调，并与HBV-DNA载量呈正相关，HBV感染、GP73高表达、IL-18高表达均是导致患者TACE术后无进展生存率下降的因素，临床应重视相关检测。