柠檬酸钾与TG酶对牛乳酸凝胶形成的协同作用

高飞，杨畅, ，李洪亮,

1.蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司（北京 101100）；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司（呼和浩特 011500）；3.蒙牛乳业（北京）有限责任公司（北京 101100）

凝固型酸奶以其独特的风味、细腻的质地和较高的营养价值而深受人们的喜爱[1-2]。但是凝固型酸奶在贮藏和运输过程中存在质地不稳定现象，突出表现为黏度降低、乳清析出和外观变粗糙等宏观现象[3]，极大地影响产品的感官性质和消费者的可接受性[4-5]。

乳蛋白是凝固型酸奶质地最重要的构筑单元[6]，其包括乳清蛋白和酪蛋白[6-7]，其中酪蛋白在牛乳中是以直径约150 nm胶束形式存在[6,8]。在菌种的作用下，酪蛋白通过非共价键形成的三维凝胶网络结构对酸奶质地的稳定性起决定作用[9-10]。TG酶是食品工业中常用的交联剂[11-12]，可通过促进酪蛋白分子间的共价交联实现如凝胶空间网络结构的调控，从而提高凝胶的质地特性[13-14]。然而，由于酪蛋白胶束较为致密的内部结构，TG酶难以进入胶束内部进行蛋白间共价交联[15]，因此TG酶处理无法形成交联度更高的凝胶网络结构，所以酸奶的凝胶强度较低与乳清析出等缺陷无法得到根本改善。

已有研究证实，钙离子的螯合剂（如柠檬酸盐、磷酸盐）可以使酪蛋白胶束分解为粒径更小的酪蛋白聚集体[16-17]，这将增加TG酶对酪蛋白的作用位点，因而可能增加酪蛋白的交联度，从而进一步改善酸奶凝胶在储存和运输过程中的稳定性。但是目前尚无关于钙螯合剂和TG酶协同处理来改善脱脂酸乳凝胶质地特性的报道。此次试验以脱脂粉复原乳为原料，以柠檬酸钾作为钙离子螯合剂，研究了柠檬酸钾和TG酶协同处理对脱脂酸乳凝胶质地和微观特性的影响。此次研究将为提高脱脂酸乳凝胶产品的稳定性和感官特性提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂乳，由三河福成生物科技有限公司提供，蛋白质含量为3.0%，于4 ℃贮藏；柠檬酸钾，广东西陇科学股份有限公司；TG酶（酶活200 U/g），德国C &P有限责任公司；复配菌种（W保加利亚乳杆菌∶W嗜热链球菌=6∶4），美国Dupont公司。

1.2 仪器与设备

CT6E日立台式离心机（长沙科美分析仪器有限公司）；Nano ZS纳米粒径分析仪（英国Malvern公司）；TA-XT+质构仪（英国Stable Micro Systems公司）；MCR302流变仪（奥地利Anton-Paar公司）；S-3000N冷冻扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 柠檬酸钾处理脱脂乳

将柠檬酸钾加到脱脂乳中，使其浓度分别达到0，5，10，20，30，40和50 mmol/L。用0.5 mol/L的HCl将各组pH调至6.6。将已分散完全的TG酶溶液按10 U/g乳蛋白的比例分别添加到各组中，25 ℃下磁力搅拌5 min使其分散，然后置于43 ℃的恒温水浴锅中1 h，使乳蛋白和TG酶充分作用。

1.3.2 酸乳样品的制备

将复配菌种按照0.2 DCU/kg添加到1.3.1中各组样品中，置于43 ℃的恒温箱中6 h，最后将样品于4 ℃保存。

1.3.3 样品测试

1.3.3.1 粒径测定

将1.3.1中TG酶处理前的样品用25 ℃的超纯水稀释500倍，利用粒径分析仪测定各组样品的粒径分布。测试时，样品的环境温度为25 ℃，动态光散射光源的散射角度为90°。

1.3.3.2 凝胶的流变学性能测定

凝胶的流变特性采用MCR302流变仪进行测定，将发酵菌种添加到脱脂乳后，迅速转移到流变仪样品测试的圆筒中，样品表面平铺一层厚度为3 mm左右的植物油，以防止样品水分的蒸发。测试时的振荡频率设定为0.1 Hz，振幅设定为1%，以确保测试所得的数据处于线性黏弹区，测试温度保持在43 ℃，凝胶时间段选取储能模量G’≥1 Pa的区域[18]。

1.3.3.3 凝胶强度的测定

将1.3.2中的样品从4 ℃的冰箱取出后，在25 ℃的室温下放置2 h，待温度恒定后，置于质构仪下方，选择直径10 mm的探头，以60 mm/min的速度从接触样品表面后匀速下降20 mm，记录凝胶强度随下降时间的变化，将凝胶破裂点的数值作为凝胶强度[19]。

1.3.3.4 凝胶持水力测定

按照1.3.2的方法制备样品，冷却至室温后，将样品置于台式离心机中进行离心（2 800g，5 min）。离心后，小心去除水层，按式（1）计算持水力（WHC）[20]。

式中：M0为离心管的质量，g；M1为离心去除水层后样品和离心管的总质量，g；M2为样品质量，g[18]。

1.3.4 凝胶微观结构的表征方法

微观结构的表征采用S-3000N冷冻电镜扫描仪，样品固定在载样平台后，在-180 ℃的液氮中迅速冷冻，并在-85 ℃下升华35 min，升华结束后，在样品表面进行喷金处理，喷金时间为90 s，喷金后，对样品表面进行实时观察[21]。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸钾对脱脂乳颗粒直径的影响

柠檬酸钾处理后脱脂乳颗粒直径的影响见图1。柠檬酸钾的浓度越高，脱脂乳中颗粒的尺寸越小，表明柠檬酸钾能有效降低脱脂乳体系中酪蛋白胶束的粒径。酪蛋白胶束是由4种蛋白单体（αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白），以及磷酸钙相互结合而成的复合物[21]。其中磷酸钙在胶束中的主要作用是对各种蛋白单体进行非共价交联，以胶态存在，也称胶态磷酸钙[22]。而柠檬酸根的钙离子螯合能力显著高于磷酸根[23]。因此柠檬酸根能有效螯合酪蛋白胶束中的钙离子，导致胶态磷酸钙的解离，从而导致胶束中各蛋白之间的连接程度降低，直观表现是脱脂乳中颗粒粒径显著减小。

图1 不同浓度的柠檬酸钾处理对脱脂乳中颗粒直径的影响

2.2 柠檬酸钾对脱脂酸奶流变学特性的影响

在TG酶浓度相同的条件下，不同浓度的柠檬酸钾处理对脱脂酸乳的储能模量G’随时间变化的影响见图2。随着凝胶时间的延长，各组的储能模量G’均呈现出逐渐上升的趋势。同时也发现，随着柠檬酸钾浓度的增加，储能模量G’从不添加柠檬酸钾时的（16.28±2.13）Pa到柠檬酸钾浓度为40 mmol/L时的（108.14±5.58）Pa，储能模量提高了7倍。通过粒径的测试结果可以看出，柠檬酸钾可以促使酪蛋白胶束的解离，使胶束内部的蛋白单体释放出来，暴露出更多的酶促反应结合位点[24]，从而增加凝胶网络中共价键的数量与强度，致使储能模量增加[25]。随着柠檬酸钾浓度的继续增大，脱脂乳无法形成凝胶，可能是由于柠檬酸根结合了大量的氢离子，使体系的pH无法达到酪蛋白的等电点。

图2 不同浓度柠檬酸钾处理对脱脂酸乳弹性模量随时间变化的影响

2.3 柠檬酸钾对脱脂酸奶凝胶强度的影响

在TG酶浓度一定的条件下，不同浓度的柠檬酸钾处理对脱脂酸奶凝胶强度的影响见图3。不经过柠檬酸钾处理且无TG酶存在时所形成的凝胶强度最低，表明TG酶能增加体系的凝胶强度。在0~30 mmol/L范围内，随着柠檬酸钾浓度的增加，凝胶强度呈显著的增加趋势；继续增加柠檬酸钾的浓度，凝胶强度未出现显著的变化。经过柠檬酸钾处理后脱脂乳中颗粒的尺寸更小，能有效地促进TG酶与酪蛋白的相互作用，从而增加酪蛋白的共价交联程度，形成更为稳定的凝胶网络结构。

图3 柠檬酸钾处理对脱脂酸乳凝胶强度的影响

2.4 凝胶持水力测定结果与分析

在TG酶浓度一定的条件下，不同浓度的柠檬酸钾处理对脱脂酸乳凝胶持水力的影响见图4。与空白组相比，仅添加TG酶的组别，持水能力虽有所提高，但无法有效地抑制乳清析出；当柠檬酸钾浓度大于20 mmol/L时，凝胶的持水力显著上升，之后基本保持平稳的状态。这是因为经较高浓度的柠檬酸钾处理，脱脂乳体系中的酪蛋白胶束得到充分的解离，酪蛋白与TG酶的结合位点增多，水分不易从凝胶网络结构中脱除；而不经过柠檬酸钾解离或解离程度不够，形成的凝胶网络结构就比较松散，在离心的作用下更容易失水而变得不稳定。

图4 不同浓度柠檬酸钾处理对脱脂酸乳凝胶持水力的影响

2.5 凝胶微观结构分析

不同浓度的柠檬酸钾处理后的各试验组脱脂酸乳凝胶的微观结构见图5。图5（A）表明在无柠檬酸钾和无TG酶的条件下形成的脱脂酸乳凝胶中几乎找不到规则的网络，表明仅依靠酪蛋白分子间的疏水作用和氢键等非共价键形成的酸凝胶结构是不稳定的；图5（B~F）是在TG酶存在的条件下，不同柠檬酸钾处理组形成的脱脂酸乳凝胶结构的微观结构图。可以看出，随着柠檬酸钾浓度的增加，形成的三维凝胶的空隙致密程度呈明显的增加现象，凝胶网格之间断裂的数量显著降低，表明在TG酶存在的条件下，随着柠檬酸浓度的增加，形成的脱脂酸乳凝胶的稳定性呈显著的增加趋势。

图5 不同柠檬酸钾浓度处理后脱脂乳凝胶体系微观结构的扫描电镜图

3 结论

此次试验以TG酶交联的脱脂乳凝胶作为研究对象，研究了柠檬酸钾的浓度对凝胶质构特性的影响。结果表明：柠檬酸钾的浓度越高，脱脂酸乳的强度越大，持水能力越强，稳定性越高。柠檬酸钾改善脱脂酸乳质构的机制是：柠檬酸根使脱脂乳中胶态磷酸钙解离，促使酪蛋白胶束分解，增加了酪蛋白与TG酶发生共价交联作用的位点，乳凝胶形成后，由于共价交联位点数量的增加，凝胶网络结构更为致密，稳定性显著提高，改善了凝胶的质构特性。