葡萄籽提取物作为食品防腐保鲜剂

尹佳，刘得鹏，谢富忠，高宇迪，李继锋

吉林化工学院生物与食品工程学院（吉林 132022）

葡萄是中国最具消费价值的水果之一，每年有将近80%的葡萄被加工处理成葡萄制品，葡萄的大量生产和消费会产生大量的副产物——葡萄废弃物（葡萄皮渣、梗、籽），占葡萄总量的20%左右。在葡萄废弃物中，葡萄籽的生物活性物质最丰富，主要有原花青素和葡萄籽多酚等活性物质。葡萄籽提取物（GSE）是一种天然的保健食品，含有丰富的多酚，如儿茶素、表儿茶素、原花青素和单体黄烷醇[1]。它拥有通过清除自由基不仅具有显著的抗氧化能力，而且由于其核心结构具有抗菌性3,4,5-三羟基苯基[2]。因为GSE具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、抗过敏、防治心血管疾病、抗衰老等多种功效[3]，故将葡萄籽废渣中的活性成分通过一些方法提取出来，充分利用食品工业残渣，可以提高食品加工副产物的利用率。GSE以优越的抗氧化活性和无副作用等受到青睐，被美国食品药品监督管理局视为安全食品。近几年GSE被广泛应用于食品、化妆品、保健品及饲料等领域，是一种具有替代或补充天然原料资源的潜力。

1 葡萄籽提取物

1.1 葡萄籽提取物的化学组成及营养成分

GSE是从葡萄籽中提取分离得到的一类多酚类混合物质，所含的酚类物质主要由酚酸类物质和黄酮类化合物组成。葡萄籽中多酚类物质的含量约692.5 mg/L[4]，主要的酚类化合物是黄酮醇、原花青素、白藜芦醇和黄烷-3-醇。杨青山等[5]研究表明不同品种的GSE中原花青素种类基本一致，但含量水平有所差异，其中原花青素B1、原花青素B2、表儿茶素及儿茶素的含量相对较高，平均超出1%含量水平。葡萄籽的主要营养成分详见表1。

表1 葡萄籽的主要营养成分[6] 单位：%

1.2 GSE的功能及作用机理

1.2.1 抗氧化活性

GSE中的酚类物质是使其具有抗氧化活性的主要原因。GSE中的酚类物质可以通过以下2种方式在食品制品中发挥其抗氧化作用：一是通过对金属离子的螯合，阻止金属离子引发自由基的生成，从而间接实现抗氧化作用[7]；二是为过氧化物自由基提供氢原子使过氧化物成为氢过氧化物，以淬灭自由基，进而改善活性氧物质的清除能力[8]。此外，GSE强大的抗氧化活性可以保护肾脏免于诱发肾病[9]。Albrahim等[10]研究结果显示给予甲状腺功能亢进症的小鼠口服GSE可将TBARS升高的水平显着降低至正常水平。此外，降低的GSH和GST均显着降低。产生显著的抗氧化活性。孙欣等[11]研究表明GSE能有效提高女运动员机体总抗氧化能力和运动能力，减轻运动员因大强度运动而引起的氧化应激、脂质过氧化损伤。GSE能够有效保护细胞膜较少的受到过氧化物的攻击，从而延缓运动疲劳，减少运动损伤的发生。

1.2.2 抗肿瘤作用

GSE中存在的酚类化合物具有抗癌和细胞周期调节活性[12]。这些酚类化合物显示出对肿瘤细胞的细胞毒活性，而不会影响正常的健康细胞。葡萄籽多酚类物质的抗癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡作用及其机制成为近年来天然抗肿瘤药物的研究热点之一。其中，葡萄籽多酚抗前列腺癌（PCA）细胞DU145的研究最为深入。有研究表明，葡萄籽多酚类物质无论在体内还是体外都能显著抑制PCA细胞的增殖，并且能以时间和剂量依赖性地诱导PCA细胞凋亡[13]。葡萄籽原花青素（GSPE）具有抗氧化、抗炎、可调节机体免疫、减轻机体损伤等能力，还能发挥抗肿瘤作用，抑制肺癌、乳腺癌和胃癌等多种肿瘤生长[14]。另外，有研究显示，诱导细胞凋亡可能是GSPE抗癌机制之一，其对骨肉瘤细胞有抑制增殖和迁移、促进凋亡、诱导细胞周期阻滞的作用[15]。GSPE作用于人食管癌细胞ECA109细胞24 h后，发现GSPE可以抑制ECA109的增殖和侵袭能力，诱导ECA109细胞凋亡[16]。故葡萄籽多酚类化合物能抑制多种肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡，而且还能拮抗化疗药物对正常细胞的毒性，因而具有较好的防癌、抗癌功效。

1.2.3 抗炎作用

GSE具有抗炎作用。许智涵[17]研究证实GSE可以通过调控导视网膜色素上皮细胞中内质网应激的IRE1-XBP1信号通路、提高分子伴侣GRP78的表达水平，从而抑制相关炎症因子的表达，最终达到抑制细胞炎症反应和保护视网膜的效果。GSPE对脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应具有抑制作用，其可能减轻中枢神经系统的炎性浸润和髓鞘的脱失，逆转BV-2小胶质细胞结构变化并抑制细胞炎症反应，从而改善中枢神经系统炎症微环境，达到治疗自身免疫性脑脊髓炎的作用[18]。张先杰等[19]用GSPE对肾血管型高血压大鼠作6周治疗后发现，与高血压模型组相比，GSPE治疗组的大鼠组血清中的肿瘤坏死因子（TNF-α）以及肾皮质、海马组织及腹主动脉中TNF-α的蛋白表达水平均显著降低，研究结果证明GSPE对促炎介质TNF-α具有一定抑制作用。

1.2.4 抗菌作用

GSE对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑菌效果。Baydar等[20]报道GSE的浓度范围在0.5%~1%区间对大肠杆菌具有普遍抑菌作用，浓度提高到2.5%时具有杀菌作用；此外，GSE在浓度1.0%，2.5%，5.0%和10.0%时对金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌均有杀菌作用。李建慧等[21]研究证明，GSE对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门杆菌、普通变形杆菌、志贺里脊杆菌、大肠艾希杆菌和枯草芽孢杆菌6种致病菌均具有明显的抑制作用。赵扬帆等[22]报道GSE对于各种各样的细菌，如酵母菌和真菌都有明显的抑制作用。上述研究结果说明将GSE添加于食品中，能明显提高食品的品质及食品的安全性。

2 葡萄籽提取物的提取纯化方法

GSE是极强性物质，可溶于水，易溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等极性有机溶剂，难溶于乙醚和氯仿等有机溶剂。GSE的提取方法主要采用溶剂萃取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶解提取法、超临界CO2萃取法、加压热水萃取法。

2.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法是根据物料中各成分在溶剂中溶解性的不同，选择对待提取成分的溶解度大、而对不需提取成分的溶解度小的溶剂，将有效成分从原料中溶解出来的一种方法。研究者最常用的提取分离GSE的方式之一。该方法的优点包括：操作可连续化，反应速度快，生产周期短；采用多级萃取时，溶质浓缩倍数越大、纯化度越高。缺点包括：抗氧化物质溶于有机溶剂后不易分离，容易造成资源浪费。卢靖等[23]从葡萄果渣中提取多酚，在50%乙醇、80 ℃提取40 min条件下，多酚提取量为3.39 mg/g，其5倍稀释液与0.1 g/L抗氧化剂二丁基羟基甲苯（BHT）的抗氧化性相当，并且多酚的抗氧化活性随着其质量浓度增加而增强。刘叶等[24]利用快速溶剂萃取仪在80%乙醇，压强8.97 MPa、50 ℃提取时间20 min的条件下，多酚提取量为28.89 mg/g。利用快速溶剂萃取仪提取葡萄籽多酚物质能极大地缩短提取时间。

2.2 超声波辅助提取法

超声波辅助提取法是将超声波产生的空化效应、振动效应、粉碎效应、搅拌效应等综合效应应用到天然产物成分的提取工艺中，通过破坏其细胞壁，增加溶剂的穿透力，从而达到高效提取细胞内容物的目的。该方法的优点是超声波提取效率高，提取温度低，能够有效保护抗氧化活性物质。缺点是获得的产品纯度不够。贾荣等[25]利用超声波法辅助乙醇提取山葡萄籽多酚，在乙醇体积分数60%、超声功率120 W、料液比1∶8（g/mL）、50 ℃提取30 min的最优条件下，多酚得率和含量为11.71%和32.86%。蒲艳[26]研究超声波辅助法提取葡萄籽提取物原花青素的工艺研究，通过单因素试验和响应面试验进行优化，确定最佳工艺参数：48%乙醇、超声功率266 W，50 ℃水浴浸提85 min，在该工艺下原花青素提取率为1.123%。

2.3 微波辅助提取法

微波可使物料的内部迅速升温，瞬间产生的高压高温可导致物料细胞破碎，有利于目标成分快速溶出，从而提高提取效率。微波辅助提取法使用的溶剂量少，提取快速，可同时测定多个样品，设备简单，操作容易，但是萃取剂的选择范围受限，通常需要选择极性大的萃取剂。王伟等[27]以乙醇作为提取剂，对葡萄籽中原花青素的提取进行优化，得到60%乙醇，液料比25∶1 mL/g，427 W微波处理3 min，在该条件下葡萄籽原花青素得率为8.66%±0.25%。师守国等[28]运用微波加热提取技术，确定提取山野葡萄皮渣中的白黎芦醇的最佳工艺条件为70%乙醇、液料比20∶1 mL/g、微波功率250 W、提取30 min，在此条件下白黎芦醇提取率可大幅提高。

2.4 超临界CO2萃取法

超临界流体萃取技术是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响，在超临界状态下，将超临界流体与待提取的物质接触，使其有选择性地依次把沸点、极性和相对分子质量不同的成分萃取出来。与传统溶剂浸提法相比，超临界萃取法的萃取效率高；可有选择地进行多种物质的分离；操作温度低，能较好保证被提取物质性能，但是该方法设备价格比较昂贵，生产成本高[29]。刘文玉等[30]采用响应面法优化超临界CO2萃取法进行葡萄籽原花青素的提取。原花青素提取工艺的最佳条件为乙醇体积分数69.22%、CO25 L/h、液料比1.13∶1 mL/g、提取压力35 MPa、温度55 ℃条件下停留62.82 min，产率和产物纯度分别达到163.60±0.93 mg/kg和88.5%，提取效果明显优于传统的提出工艺。宗建军等[31]利用超临界CO2萃取技术从葡萄籽中提取含有不饱和脂肪酸的葡萄籽油，预测在萃取压力28 MPa、CO215.5 L/h、萃取温度321 K最佳条件下停留时间155 min，萃取率达到14.12%。

3 葡萄籽提取物的安全性

葡萄属于生活中比较常见的水果，虽然葡萄籽一般不直接食用，但经试验证实GSE具有很高的食用安全性，急性毒性和慢性长期毒性试验均未见毒副作用。据报道[32]，食用GSE的2.0%~2.5%对大鼠没有不良影响。在大鼠中口服给药后未观察到明显的GSE严重毒性。大鼠GSE的致死剂量（LD50，对50%的测试模型具有致命作用的物质的剂量）高于4 000~5 000 mg/kg[33]。沈继红等[34]将葡萄多酚以10 g/kg剂量灌胃小鼠，14 d内动物无死亡，不同性别的小鼠均未见明显的中毒症状，研究结果证明该物质属实际无毒物质。国际上对GSE尚无用量方面的规定。欧美、日本等国家将GSE作为膳食补充剂的一般推荐用量为150~300 mg/d，而在食品工业中则以低浓度（0.01%~1%）使用[35]。中国常用量与国际上基本一致。

4 葡萄籽提取物在食品领域的应用

4.1 在果蔬中防腐保鲜的应用

GSE对减少化学合成防腐剂的使用和降低环境污染具有重要的现实意义。杨晶琪等[36]研究表明，1%GSE负压渗透处理可显著抑制青霉菌（Penicillium expansum）和链格孢菌（Alternaria alternata）这2种病原菌在鸭梨果实上的发病率及病斑直径扩展，最终可以延缓鸭梨果实的成熟衰老，减少贮藏期间失重率、腐烂率及果柄褐变程度。有研究显示GSE处理能明显降低桃果实贮藏期自然腐烂率和减轻果肉褐变，抑制多酚氧化酶（PPO）活性；延缓桃果实硬度、可滴定酸含量的下降；保持较高的可溶性固形物和抗坏血酸含量[37]。吴宁等[38]将GSE应用于香菇保鲜中，结果表明一定浓度的GSE能有效延长香菇保鲜时间，5 g/L葡萄籽提取物的保鲜效果最理想。GSE在提高果实抗病性及采后贮藏品质的应用上具有重要意义，有望开发成为相对安全、无公害的果实防腐保鲜剂。

4.2 在肉类中防腐保鲜的应用

肉类制品在贮藏中易发生氧化反应，产生变味及变色现象，造成营养成分损失，为使肉类在货架期内保持良好品质，添加抗氧化剂非常必要。李超等[39]研究表明，添加0.25% GSE能明显减缓发酵鸭肉香肠的氧化速度和产酸速度，进而提高香肠贮存期稳定性。张涛等[40]指出，GSE能提高发酵猪肉香肠的氧化稳定性，进而提高香肠的货架期。金海莉等[41]通过对延边黄牛肉样品的表面颜色、感官评定、pH、滴水损失率、挥发性盐基氮值及菌落总数的测定，综合分析得出GSE对延边黄牛肉保鲜的最佳质量分数是0.10%，且GSE试验组样品比对照组样品的保鲜期延长2~4 d。GSE能够提高秘鲁鱿鱼鱼丸的持水性，降低鱼丸中水分的流动性，抑制氧化三甲胺的热分解，降低鱼丸中TMA、DMA和甲醛含量[42]。在白鲢鱼丸中添加量0.1 g/kg迷迭香提取物和0.3 g/kg葡萄籽提取物时，白鲢鱼丸的保鲜效果最优，可明显抑制微生物生长，延缓鱼丸品质劣变，延长货架期[43]。因此，GSE保鲜剂在肉类制品保鲜中拥有广阔市场前景。

5 结语与展望

中国的葡萄资源比较丰富，葡萄年产量位居世界前列，随着食品加工行业的深入发展，葡萄籽废弃物——葡萄籽产量会越来越多，所以利用食品工业废果渣提取天然保鲜剂有着极为广阔的发展前景。GSE作为天然抗氧化剂、天然防腐剂和营养强化剂在食品中应用，符合消费者追求食品安全性和营养性的需求。GSE提取工艺简单，成本低，具有多种营养成分，随着葡萄籽副产品的开发利用，GSE的研究开发都具有深远意义。