豆浆凝固过程中的动态特性

赵行，陈令芬，张维，胡馨月，刘冰，孟旭

江苏海洋大学食品科学与工程学院（连云港 222005）

作为大豆的主要进口国，我国对大豆的需求量极大。大豆中富含大量的蛋白质及油脂，能够满足人体所需。随着生活水平的不断提高，人们对大豆的营养价值有了更深的认知。研究发现，大豆类的食品不仅可以预防心血管疾病、癌症、骨质疏松等疾病，同时还起到一定的保健作用[1]。豆腐作为我国的传统大豆食品之一，历史悠久，其风味和营养价值深受消费者喜爱。豆腐凝胶的形成是凝固剂释放出的离子作用于大豆蛋白分子，使蛋白分子大量聚集形成具有三维网状结构的蛋白凝胶产品。在豆制品加工过程中，凝固剂的种类极大影响豆制品的品质。

很多研究者通过对豆腐的物理性研究得出最佳的凝固效果，侧重点在物理研究方面如凝胶强度、持水率等，以这些为指标判断凝固剂的强弱。但在制作过程中，凝固的工艺参数不确定及其时间点的差异，制成的豆腐质量差异很大。为了满足豆腐的标准化生产，对不同凝固剂在豆浆中如何凝固成豆腐这个过程的研究很有意义。

豆浆在凝固过程中凝胶网络结构的形成，可以通过测定豆浆体系的动态流变特性来分析研究[2]。有研究表明，豆浆中凝固剂的pH下降速度影响蛋白质的凝固速率。因此，在豆腐凝胶过程中可以用动态流变试验和动态pH进行监测研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

大豆（产于东北，市售）；食品级氯化镁（安琪酵母股份有限公司）；食品级硫酸钙（枣庄市聚隆石膏制品有限公司）；食品级葡萄糖酸-δ-内酯（安徽省兴宙医药食品有限公司）；食品级消泡剂（安琪酵母股份有限公司）。

1.1.2 仪器与设备

FDM-Z100型自分离大豆磨浆机（保定智香修信厨具有限公司）；BP221S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Seven Easy S20 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ENCL-G-3恒温磁力搅拌器（上海易研实验设备有限公司）；MCR 102旋转流变仪（安东帕中国有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备流程

精选黄豆→精选浸泡→磨浆滤浆→煮浆灭酶→冷却保藏

精选新鲜大豆，去除发霉、不饱满的颗粒，反复清洗3~5次。按照料水比1∶3（g/mL），在20 ℃条件下浸泡8~10 h。磨浆、滤浆，按干大豆与水1∶7（g/mL）的比例进行磨浆处理，通过0.125 mm滤网将滤渣去除。将研磨好的豆浆在煮浆前，加入一定量（豆浆比重的0.3%）的大豆磷脂。煮浆，将豆浆煮至沸腾持续5 min，过程中须不断搅拌，防止豆浆底部温度过高引起糊底。待豆浆冷却至室温，放入4 ℃的冰箱中备用。

1.2.2 动态pH的测定

量取100 mL样品放入烧杯中，放置在磁力搅拌器上搅拌。精确称取0.350 0 g（精确到0.000 1 g）凝固剂倒入样品中。盖上保鲜膜密封（升温-保温阶段减少热量散失），将pH计探头放入样品中。开启加热，从25 ℃升温至90 ℃，紧接着在90 ℃下保温10 min，然后关闭加热，去除保鲜膜，将90 ℃降温至25 ℃。记录在变温过程中凝固剂在豆浆中pH的变化。

1.2.3 温度扫描试验

利用MCR 102旋转流变仪的振荡模式测定新鲜豆浆凝胶的流变性质，选用的转子为50 mm平板，间隙值为1 mm。根据Murekatete等[3]的方法并作适当改动。量取10 mL新鲜豆浆和凝固剂（添加量0.35%），混合30 s后立即上样，刮边除去多余的液体后在转子四周涂抹上凡士林，防止高温下水分蒸发损失，随后立即进行温度扫描试验。

温度扫描参数：应变1%（线性范围区内），频率1 Hz。温度循环：首先以5 ℃·min-1的速率从25 ℃升温至90 ℃，紧接着在90 ℃下保温10 min，然后再以5 ℃·min-1的降温速率从90 ℃降温至25 ℃。记录弹性模量G’和黏性模量G’随温度和时间的变化情况[4]。

1.2.4 频率扫描试验

在25 ℃条件下对凝胶进行频率扫描，应变设为1%，频率扫描的角频率设为1~100 rad/s，记录G’随角频率的变化情况。

1.2.5 蠕变-恢复试验

蠕变-恢复试验参照Bi等[5]的方法且略有改动。在25 ℃条件下对豆腐凝胶施加8 Pa的剪切应力，持续5 min，记录应变随时间的变化情况；然后撤去应力，继续记录5 min内应变随时间的回复情况。豆腐凝胶的蠕变数据利用四参数Burger’s模型方程进行拟合。因为在食品体系中，研究者大多选用Burger’s模型来进行蛋白、多糖等凝胶黏弹性质的表征[6-8]，其由Kelvin-Voigt和Maxwell两个模型串联而成，较为简单，但能够提供比较合理的分析结果[9]。该模型方程如式（1）所示[10]。

式中：J为柔量，即应变和应力的比值，1/Pa；G0为瞬时弹性模量，Pa；G1为弛豫弹性模量，Pa；λ为弛豫时间；µ0为黏性因子，Pa·s。

凝胶样品的恢复情况用恢复率来表示，按式（2）计算。

1.3 数据统计分析

所有试验数据如无特别说明，均为3次平行试验获得的平均值，使用统计软件SPSS 26进行数据分析，利用Origin Pro 2019b软件作图。

2 结果与分析

2.1 动态pH的测定结果分析

由图1可知，在升温-保温-降温三个阶段中，3种凝固剂pH变化趋势基本一致。在升温阶段，随着温度不断上升，3种凝固剂pH均出现下降趋势，下降速率最快是葡萄糖酸-δ-内酯（GDL），说明温度对GDL释放速度影响最大。随着温度的增加，GDL加快水解的速度，生成葡萄糖酸同时释放出里面H+，溶液的pH下降并向大豆蛋白等电点移动。H+的释放引起蛋白质表面电量下降，降低了蛋白表面的静电排斥作用，破坏了胶体稳定性，在氢键、疏水相互作用下蛋白质交联形成大豆蛋白凝胶[11-12]。其次是氯化镁，硫酸钙最小。随着温度的增加，其加快氯化镁、硫酸钙在豆浆中的解离速度，释放出Mg2+和Ca2+，Mg2+和Ca2+不仅能够屏蔽蛋白质分子表面的负电荷，破坏水化膜和双电子层，而且能够与羧基上的H+发生交换，形成镁桥或者钙桥。大豆蛋白通过静电相互作用、疏水聚集以及镁桥或者钙桥相互聚集、连接形成凝胶网络结构[13-14]。在保温阶段，随着时间的推移，3种凝固剂pH无明显增长或下降趋势，pH处于极为平稳状态。说明3种凝固剂在豆浆中完全溶解，里面的离子得到释放并与豆浆中的蛋白结合。在降温过程中，随着时间增加，3种凝固剂均出现上升趋势。主要原因是在加热中，凝固剂与豆浆中的蛋白结合生成部分可逆性型凝胶，在降温过程中，温度下降可逆性凝胶中的变性蛋白有可能发生部分复性，复性后蛋白分子可用于分子间交联的活性基团减少，氢键增加引起pH的上升。从图1可以观察到，在降温结束后，豆浆中各凝固剂pH的大小为氯化镁＞硫酸钙＞GDL。

图1 动态变温试验pH的变化

2.2 温度扫描试验结果分析

动态温度扫描结果如图2和图3所示。在整个的变温过程中，弹性模量G’和黏性模量G’变化趋势一致。在升温初期，随着时间增加，3种凝固剂的G’和G’开始下降，说明在振荡过程中，豆浆中的蛋白质分子间氢键作用减小，G’减小，溶液黏度下降，没有凝胶生成。加热到65 ℃以上，豆浆与凝固剂反应，蛋白质分子间氢键剧烈增加，G’不断上升开始形成凝胶。温度继续上升，氯化镁G’和G’’增加，但另外两种凝固剂随着时间的不断增加G’和G’’突然下降，可能是由于在不停振荡中刚形成的凝胶遭到破坏，弹性和黏性模量降低。同时表明氯化镁中的Mg2+与蛋白结合聚集形成较为紧密的凝胶。在恒温过程中，G’、G’随时间的增加而缓慢增加，整体G’大于G’，表明更多的蛋白质参与凝胶网络的形成，当G’和G’达到一定的值后，基本保持不变，这与凝胶中疏水相互作用的形成以及凝胶终点的到达有关[15]。在降温过程中，G’和G’继续上升，凝胶结构逐渐增强，这与凝胶结构的分子重排及更强化学键的形成有关，主要包括氢键的形成。氢键在低温下可克服蛋白结构内部侧链间的静电斥力，从而引起G’和G’的升高[16-17]。从图2中可以观察到，在降温结束这3种凝固剂，GDL的G’最大，其次硫酸钙，氯化镁最小。G’越大，其凝胶强度越大[18-19]，说明3种凝固剂的凝胶强度大小为GDL＞硫酸钙＞氯化镁。这与上述动态pH下降速率保持一致，这也验证了豆腐凝胶的pH降低程度决定蛋白质的凝固速率，pH下降速率越快，蛋白质凝固速率越快[2]。

图2 G’—温度扫描变化

图3 G’—温度扫描变化

tanδ[1]=G’/G’，称为损耗因子，表示黏性相对弹性部分的比值。tanδ=1，即G’=G’，黏性和弹性相等，称为凝胶点。tanδ＜1，即G’＜G’，弹性占主要部分，为凝胶体。tanδ＞1，即G’＞G’，黏性占主要部分，为流体。

由图4可知：在升温过程中，3种凝固剂初始tanδ＞1，说明整个溶液以黏性占主要部分，呈现流体状态。随着时间增加，tanδ均出现上升后降低趋势，表明在振荡过程中，G’增长迅速，黏性增加；随后降低说明温度升高豆浆的黏性下降，G’迅速增加；保温过程中，3种凝固剂的tanδ值达到最低点并基本保持不变，说明凝固剂与豆浆中的蛋白结合较为紧密，G’达到最大值；降温过程中，随着时间的增加，温度不断下降，tanδ出现上升趋势，说明G’’增加，但整体tanδ＜1，表明整个系统G’占主导，呈现凝胶化。

图4 tan δ—温度扫描

2.3 频率扫描试验结果分析

由图5和表1可知：氯化镁、GDL、硫酸钙在豆浆凝固过程中G’随着角频率ω的增大先增加后趋于平稳，呈现出较弱的频率依赖性；使用幂律方程G’=k’·ωn对G’和ω的关系进行拟合，可以得到n值。n值可以用来表示形成凝胶结构中作用力的性质，n=0说明凝胶为化学性凝胶，由较强的共价键组成；n＞0则表示物理性凝胶，即主要作用力为弱的非共价键[20]。由表1可知，氯化镁、GDL、硫酸钙其凝胶得到的拟合参数n分别为0.055 7，0.037 8和0.028 9，其n值均大于0，表明是物理性凝胶，是一种“弱凝胶”，这也进一步证明了前面的结果[21-22]。

图5 G’—频率扫描变化

表1 幂律方程拟合的参数值

2.4 蠕变-恢复试验结果分析

蠕变-恢复试验，记录在恒定剪切应力的条件下，持续一段时间豆浆在凝胶的形变随时间的变化情况及撤去应力后凝胶的恢复情况，结果可以用来比较凝胶的刚性特征[23]。由图6可知，GDL诱导豆浆凝胶乳表现出很弱的抵抗形变的能力，相比于另外两种凝固剂诱导的凝胶，其凝胶结构相对较弱[24]。利用Burger’s模型方程对蠕变数据进行拟合，采用流变仪自带的拟合软件将4个参数G0、G1、λ、μ0拟合出来，结果均表现出很好的拟合性（R2＞0.99），拟合得到的参数如表2所示。氯化镁诱导的凝胶具有最大瞬时弹性（G0），说明具有最大的硬度。弛豫弹性模量（G1）可以用来表征凝胶内部的凝聚力，反映其对形变的抵抗能力[25]。黏性因子（μ0）是凝胶的黏性指数。GDL诱导凝胶具有最大的G1和μ0，这可能是由于形成凝胶的作用力比其他两种更强的原因所导致的。推迟时间（λ）代表达到凝胶最大形变的（1-1/e）所需要的时间，λ越大，表示达到完全形变越缓慢[24]。在恢复试验结束后，由于施加恒定的剪切应力的作用会影响大部分凝胶发生形变达到最大，这部分形变称为总形变。极小一部分形变由于撤掉应力无法恢复回来，这部分形变称为永久形变。而可以恢复的形变与总形变的比值称为凝胶的恢复率。从表2可以看出，氯化镁诱导的凝胶具有最大的恢复率，其次是GDL，硫酸钙的最小，这与蠕变数据一致，豆浆凝胶如果具有较大的抵抗形变的能力，能够耗散的变形能量更多，则表现出更好的恢复能力。

图6 剪切应变—时间变化

表2 Burger’s方程拟合四参数

3 结论

通过变温扫描、频率扫描、蠕变-恢复试验可知，凝固剂的种类和pH对豆浆凝固过程形成凝胶有很大影响。不同种类的凝固剂形成凝胶机理不同，对生成凝胶的强弱起着决定性作用。在动态变温过程中，温度变化对pH下降速率有着很大影响，温度越高，pH下降速率越快。在升温过程中，随着温度的增加，凝固剂的pH不断下降。升温初期，弹性模量G’、黏性模量G’不断下降，这与初始pH变化趋势一致。随着温度的继续升高，G’、G’出现先增加后下降再上升趋势，由于释放的离子与蛋白结合不够紧密，在振荡过程中，凝胶遭到破坏。随着pH不断下降，各凝固剂释放离子浓度增加与豆浆中的蛋白结合紧密从而生成凝胶。豆腐凝胶从液转变为固态体，表现出固体的性质。在保温凝固过程中，G’、G’和pH几乎无上升或下降趋势，说明各凝固剂离子得到完全释放，与蛋白充分结合起来，生成较强的凝胶。在降温凝固过程中，G’、G’和pH均出现上升趋势，说明在低温条件下，氢键克服蛋白结构内部侧链间的静电斥力引起G’、G’和pH上升。在降温结束后，3种凝固剂G’的大小决定凝胶强弱为GDL＞硫酸钙＞氯化镁，豆浆中各凝固剂pH的大小为氯化镁＞硫酸钙＞GDL。试验发现，凝胶强度与pH大小呈反比，pH越低其凝胶强度越强。