基于Box-Behnken法的灵芝孢子粉片剂配方优化

张剑，弓志青，崔文甲，万婕，王文亮，李永生

1.山东省农业科学院农产品研究所（济南 250100）；2.山东省农产品精深加工技术重点实验室（济南 250100）；3.农业部新食品资源加工重点实验室（济南 250100）

灵芝（Ganoderma lucidum）又称“瑞草”“仙草”“还魂草”，属于担子菌门担子菌纲多孔菌科灵芝属，是我国重要的药用真菌。自古以来，传统中医就将灵芝视为珍贵药材，其有扶正固本、延年益寿之功效[1]。灵芝孢子粉是灵芝子实体发育成熟期从菌盖中弹射出来的卵型生殖细胞，大小在4~10 μm[2]，含有多糖[3]、三萜[4]、甾醇[5]等多种生物活性成分，具有抑制肿瘤细胞生长[6]、免疫调节[7]、保肝[8]、降血糖[9]、抗氧化[10-11]等药理活性。因此，灵芝孢子粉成为当前研究的热点，在保健市场上越来越受到消费者的青睐[9,12]。

目前，灵芝孢子粉经历了未破壁灵芝孢子粉、破壁灵芝孢子粉、去壁灵芝孢子粉三代技术变革，但其主要是以粉剂、颗粒剂、胶囊等剂型存在[12]，以上产品有容易吸潮变性、食用不便的缺点。片剂产品由于食用方便及便于携带，受到消费者的喜爱。由于灵芝孢子粉富含油脂类物质，分子间的凝聚力减弱，压片时易造成松片，增加了片剂成型的难度；另外，其含有三萜类物质，导致片剂发苦[13]，产品接受度低。为解决以上问题，此次研究在递次混合前处理及湿法造粒压片技术的基础上，以灵芝孢子粉、吸油剂、玫瑰粉的添加量为响应因素，片剂外形、片重差异、硬度及脆碎度的综合评分为响应值，采用响应面分析优化灵芝孢子粉片剂的配方，以期为灵芝孢子粉的进一步综合开发利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

破壁灵芝孢子粉（破壁率≥98%，聊城冠县店子镇）；玫瑰粉（山东济南市平阴县）；二氧化硅（佳味源实业有限公司）；甘露糖醇（河南万邦实业有限公司）；羧甲基纤维素钠（南通泰利达新材料有限公司）；硬脂酸镁（河南万邦实业有限公司）。以上均为食品级。

1.1.2 仪器与设备

AR423CN电子天平：奥豪斯（上海）仪器有限公司；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；YK-60摇摆式颗粒机（长沙市中南制药机械厂）；TDP-5T单冲压片机（长沙市中南制药机械厂）；TA.XT.plus质构仪（超技仪器有限公司）；CS-I脆碎度检查仪（天津市旭阳仪器设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程及操作要点

图1 灵芝孢子粉片剂制作工艺流程图

递次混合法混合：根据试验配方，首先将灵芝孢子粉和吸油剂（二氧化硅与β-环状糊精比例为1∶1）进行研磨混合，充分吸附灵芝孢子粉中的油脂性物质，再加入玫瑰粉及甘露糖醇，通过研磨获得粒度均一的物料。

制软材：将混匀的物料，加入适量黏合剂2%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），制成“轻握成团，轻压即散”的软材。

造粒：将软材放入造粒机的料斗内进行造粒，其中筛网目数为0.850 mm（20目）。

干燥：在50 ℃烘箱中进行干燥，烘至物料含水量在3.5%~5%即可。温度不宜过高，否则会破坏灵芝孢子粉中的营养成分。

整粒：将干燥后的颗粒与1%硬脂酸镁混匀，再次放入造粒机中过0.850 mm（20目）的样品筛进行整粒。

压片：将经过整粒的物料放入压片机进样斗中进行压片，其中填充压力40 kN，填充深度12 mm。

1.2.2 单因素试验设计

试验选择灵芝孢子粉添加量（10%，20%，30%，40%和50%）、吸油剂添加量（10%，15%，20%，25%和30%）、玫瑰粉添加量（0，5%，10%，15%和20%）为考察因素，以造粒后物料流动性、片剂外观、硬度和片重差异为检测指标，探讨各因素变化对灵芝孢子粉片剂品质的影响。

1.2.3 响应面试验设计

在单因素的基础上，选择灵芝孢子粉添加量、吸油剂添加量、玫瑰粉添加量为因变量，以片剂综合评分为响应值，设计三因素三水平响应面试验，因素水平设计方案见表1。

表1 Box-Behnken 试验设计方案 单位：%

1.3 检测方法

1.3.1 物料流动性

采用固定漏斗法测定物料的休止角，评价物料的流动性[14]。其中：当休止角大于45°时，其流动性较差；当休止角小于40°时，其流动性良好；当休止角小于35°时，其流动性极好。

1.3.2 片剂外观

采用目测法直接对片剂进行观察评价，片剂应色泽均匀，表面光洁，无碎粉。

1.3.3 片剂差异

采用称量法，取20片灵芝孢子粉片，精确称量每片质量及总质量，并计算平均片重。超出片重差异的不得多于2片，不得有1片超出限度的1倍。根据《中国药典》规定，平均质量超过0.3 g的片剂，质量差异为±5%。

1.3.4 片剂硬度

为了便于试验的进行及指标的可评价性，采用两种方式进行硬度检测。单因素试验：把制成的片剂从1 m高处自然掉落在2 cm厚的松木板上，碎片率不超过30%为合格[15]；响应面分析：采用质构仪检测片剂硬度。测试条件：SMSP/36R压盘式探头；测试模式，压缩；位移距离3.000 mm；测试前速度1.00 mm/s；测试中速度0.30 mm/s；测试后速度10.00 mm/s；感应力0.050 N；测定指标，硬度。

1.3.5 片剂脆碎度

采用脆碎度检测仪测定。测定条件：转速25 r/min，转动100次。操作方法：取15片灵芝孢子粉片，用吹风机吹去脱落的粉末，精密称其质量，置圆筒中转动100次后取出，同法除去粉末，精密称其质量，减少质量不得大于1%，且不得检出断裂、龟裂及粉碎的片。

1.4 片剂综合评价指标

以片剂外观、片重差异、硬度和脆碎度为评分指标，采用多指标综合评价的方法进行综合评价[14,16]，相关指标评分标准见表2。

表2 片剂多指标综合评分表

1.5 数据处理

采用Designer-Expert.V8.0.6.0及Microsoft Office Excel 2016对数据进行处理并分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验设计

2.1.1 不同灵芝孢子粉添加量对片剂品质的影响

物料的性质关系到压片过程的顺利与否和片剂质量的好坏。灵芝孢子粉富含油脂类物质，表面张力较大，其流动性和可压性均比较差，不易进行压片。由表3可以看出，随着灵芝孢子粉添加量的增加，物料的流动性逐渐变差。片剂外观也逐渐变得不光滑，并出现碎粉。片剂硬度也逐渐不符合要求，当灵芝孢子粉添加量达到50%时，未能成片。结合片重差异性指标，灵芝孢子粉的最佳添加量为30%。

表3 不同灵芝孢子粉添加量对片剂品质的影响

2.1.2 不同吸油剂添加量对片剂品质的影响

灵芝孢子粉中油脂类物质含量较高，导致制粒时颗粒松散、流动性差，压片时会出现硬度不够、难以成片的现象。为解决该问题，选用具有吸附功能的辅料二氧化硅和β-环状糊精作为吸油剂[17]，采用递次混合预处理的方法吸附灵芝孢子粉中的油脂类物质。由表4可以看出，随着吸油剂添加量的增加，造粒后物料的流动性逐渐增强，片剂的外观、硬度及片重差异性均呈现一致的趋势。综合各个指标，吸油剂的最佳添加量为20%。

表4 不同吸油剂添加量对片剂品质的影响

2.1.3 不同玫瑰粉添加量对片剂品质的影响

灵芝孢子粉中含有三萜类物质，使其呈现出一种苦味[13]，这会影响灵芝孢子粉片剂的接受度。天然物质玫瑰粉的加入可掩盖灵芝孢子粉令人不悦的气味，使片剂赋有淡淡的玫瑰花香。由表5可以看出，随着玫瑰粉添加量的增加，物料流动性逐渐增强，片剂的硬度也逐渐提高，片剂的表面逐渐变得光滑，但碎粉却呈现由多到少再到多的变化，片重差异性则是添加量为10%时最佳。综合各个指标，玫瑰粉的最佳添加量为10%。

表5 不同玫瑰粉添加量对片剂品质的影响

2.2 响应面试验设计

2.2.1 响应面试验设计及结果

为了筛选灵芝孢子粉片剂的最佳配方，以片剂综合评定值Y为响应值，采用Box-Behnken响应面法对试验进行优化，响应面试验设计方案及结果见表6。以灵芝孢子粉添加量A、吸油剂添加量B、玫瑰粉添加量C为因变量，以综合评定值Y为响应值建立方程，得到方程：Y=21.55-1.22A-0.32B+0.16C-1.24AB-0.68AC+0.17BC-2.18A2-2.19B2-3.67C2，该方程回归系数R2=0.979 6。

表6 响应面试验设计及结果

由表7可以看出：模型的p＜0.000 1，说明其具有极显著性，回归方程模型中失拟项p=0.062 9＞0.05，失拟项不显著，说明得到的回归模型比较理想，方程有极高可靠性；在试验的3个影响因素中，灵芝孢子粉添加量的单因素p值小于0.01，说明对片剂综合评定值的影响极显著；相比较，灵芝孢子粉添加量与吸油剂添加量的交互作用对片剂综合评定值也有显著影响，但不如灵芝孢子粉添加量影响大；由F值可以看出，A、B、C三个因素对片剂综合评定值的影响为A＞B＞C，即灵芝孢子粉添加量＞吸油剂添加量＞玫瑰粉添加量。

表7 方差分析结果

2.2.2 响应面交互分析

三个因素的交互作用及其最佳工艺参数可以由响应面的分析图得出，如图2~图4所示。图2为变量C取零时综合评定值随AB的变化图。图3为变量B取零时综合评定值随AC的变化图。图4为A取零时综合评定值随BC的变化图。响应面图是由各个试验因素和响应值Y构成的三维空间图，试验因素的交互作用强弱可以由等高线形状看出，椭圆形等高线代表试验因素的交互作用影响显著。从试验结果可以看出灵芝孢子粉添加量与吸油剂添加量的交互作用影响显著。

图2 灵芝孢子粉添加量和吸油剂添加量对综合评定值交互影响的响应面与等高线

图3 灵芝孢子粉添加量和玫瑰粉添加量对综合评定值交互影响的响应面与等高线

图4 吸油剂添加量和玫瑰粉添加量对综合评定值交互影响的响应面与等高线

2.2.3 响应面结果验证试验

利用Design-Expert.V8.0.6.0软件得到灵芝孢子粉片剂的最优配方条件：灵芝孢子粉添加量27.09%、吸油剂添加量20.05%、玫瑰粉添加量10.25%，综合评定值为21.73。考虑到实际操作的可行性，将最优配方调整为灵芝孢子粉添加量27%、吸油剂添加量20%、玫瑰粉添加量10%，剩余由填充剂甘露糖醇补充。按此配方进行3次重复验证试验，综合评定值的平均值为21.68，与预测值有较好拟合性，说明响应面优化试验得到的灵芝孢子粉片配方具有实际参考价值。

3 讨论

根据制备工艺的不同，可将压片方法分为粉末直接压片法、干法制粒压片法及湿法制粒压片法[18]。粉末直接压片法要求物料具有良好的流动性、可压性及润滑性；干法制粒压片法则需要较大压力使物料达到所需要的密度，只适合特定的需要干法制粒的物料[19]。湿法制粒压片法可有效改善物料的流动性及可压性，工艺比较成熟，重复性高，易进行工业化生产。结合灵芝孢子粉颗粒细小、质地松软、流动性较差、富含油脂类物质的物性学性质，此次试验采用湿法制粒压片法进行压片，大大提高了灵芝孢子粉的流动性及可压性。

片剂处方中辅料的选择应该结合主料的性质特点，达到改善物料可压性、流动性的目的。灵芝孢子粉富含油性成分，制粒时会出现颗粒松散、流动性差，压片时会出现硬度不够、难以成片的现象，因此需要选择合适的辅料吸收油性成分后，再进行造粒压片[20]。二氧化硅是具有絮状轻质的白色粉末，具有很好的流动性，在片剂生产中，常作为助流剂使用；β-环状糊精具有特殊的穴状分子结构，可通过包合作用吸附油脂性物质。此次试验采用递次混合的方式首先将灵芝孢子粉与吸油剂（二氧化硅和β-环状糊精）进行混样，对油脂性物质进行吸附，使造粒后灵芝孢子粉颗粒的流动性增强，解决了灵芝孢子粉难以压片成型的问题。

灵芝孢子粉中含有三萜类物质，使其呈现出一种苦味，这会影响灵芝孢子粉片剂的接受度。此次试验在前期试验的基础上，筛选天然物质玫瑰粉作为复配材料，天然物质玫瑰粉的加入可掩盖灵芝孢子粉令人不悦的气味，使片剂赋有淡淡的玫瑰花香，避免了矫味剂的添加，还增加了片剂的硬度，这可能是此次试验采用的玫瑰粉粒度比较小，填充了颗粒之间的空隙，进而增加了片剂的硬度。

4 结论

在片剂处方确定的基础上，分别考察灵芝孢子粉、吸油剂、玫瑰粉的添加量对片剂品质的影响，以片剂外形、片重差异、硬度及脆碎度的综合评定值为响应值，采用Box-Behnken响应面法对片剂配方进行优化。结果表明，灵芝孢子粉片剂最佳配方为灵芝孢子粉添加量27%、吸油剂添加量20%（二氧化硅∶β-环状糊精为1∶1）、玫瑰粉添加量10%、甘露糖醇添加量43%。在此条件下，灵芝孢子粉片剂的综合评定值为21.68。片剂呈棕褐色，色泽均匀，表面光滑、完整，赋有玫瑰淡淡的花香，便于携带服用，发挥其增强人体免疫力的功效。该研究可为灵芝孢子粉片剂的生产提供一定的参考。