桑黄液体培养基优化及饮品加工工艺

谢春芹，许俊齐，黄小忠，张雪松，张博士

江苏农林职业技术学院（句容 212400）

桑黄（Phellinus igniarius）是一类具有重要药用价值的大型真菌，属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、层孔菌属[1]。学名鲍氏层孔菌，又称火木层孔菌、桑臣、桑耳等，子实体无柄，菌盖扁马蹄形或半球形，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，是一种寄生于腐烂桑树上的多年生真菌。桑黄中的活性成分具有抗菌、抗癌、保肝、提高免疫力的功效，是目前国际公认的生物抗癌领域中疗效非常好的药用真菌[2-5]。

桑黄作为一种名贵中药，富含丰富的多糖类、黄酮类、酚类和萜类等成分[6]。其抑制肿瘤的研究主要集中在具有药理功能的成分桑黄多糖方面，桑黄的抗癌多糖来源包括子实体多糖、菌丝体及发酵液多糖。作用机制是通过细胞调节和体液免疫来提高机体的免疫力，进而达到抑制肿瘤细胞生长和转移的目的[7-9]。

由于受自身生物特性和外界环境的影响，野生桑黄菌子实体稀少，人工栽培周期长，无法满足人们对珍稀桑黄菌资源的广泛需求，对桑黄菌进行人工发酵培养以获取桑黄菌丝体为其产业化开发提供了可能，且发酵周期短，不受季节和环境的限制，发酵所得菌丝体多糖与子实体多糖功效相当[10]。

此次试验通过对桑黄进行液体深层发酵培养，分析相应碳源、氮源及微量元素对其菌丝干质量与总多糖含量的影响。在此基础上，对桑黄菌丝发酵饮品调配配方进行优化，以期为桑黄菌丝新型产品开发提供借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑黄，由江苏食用菌研究所提供；白砂糖、马铃薯等，为市售食品级；葡萄糖、磷酸二氢钾、蛋白胨，国药集团化学试剂有限公司。

恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；FA 2104 N分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；DHG-9123 A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；L 520微波炉（合肥荣事达三洋电器股份有限公司）；CH2176电磁炉（杭州九阳生活电器有限公司）；HS-6恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 培养基

1.2.1 斜面PDA培养基

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。

200 g马铃薯切成1 cm3的小块，倒入1 000 mL的水中，煮沸至变软，用四层纱布过滤，过滤以后的滤液内加入琼脂葡萄糖，继续加热，不停地搅拌，然后补水至1 000 mL，将桑黄菌接种于PDA斜面培养基上，于28 ℃恒温培养6 d。

1.2.2 一级液体培养基

葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，VB10.005%，余量为水。

向250 mL三角瓶中加入100 mL一级液体培养基，进行120 ℃灭菌30 min。接种斜面保存的桑黄菌，置于28 ℃，120 r/min的摇床环境中培养6 d。

1.2.3 二级液体培养基

马铃薯20%，硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VB10.005%，余量为水。

用打孔器从平板中取出5块直径5 mm的活化菌种块，接入液体种子培养基中，在120 r/min，25 ℃，无光的环境中培养7 d。

1.3 试验方法

1.3.1 桑黄菌丝饮品加工步骤

1.3.1.1 菌种活化

将桑黄菌种接种到斜面培养基上，在28 ℃的生化培养箱中培养5~7 d，菌丝可长满试管。

1.3.1.2 一级摇瓶培养

将经过活化的桑黄菌种接种到摇瓶培养基中（500 mL的三角瓶装液150 mL），一级摇瓶培养条件为接入经过斜面培养的桑黄菌种2 cm2，在28 ℃条件下振荡培养5~6 d。

1.3.1.3 二级摇瓶培养

将一级摇瓶培养桑黄菌种，接种到摇瓶培养基中进行二级摇瓶培养，在28~30 ℃条件下，培养8 d，所得桑黄菌种为生产摇瓶二级种。

1.3.1.4 发酵培养

将二级种接入发酵培养基中，二级种与发酵培养基的体积比为10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵培养5 d，进行扩大培养，得到一级桑黄菌种。

1.3.1.5 发酵罐培养

一级桑黄菌种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养24~36 h后，过滤，得桑黄菌丝。

1.3.1.6 桑黄菌丝饮品制备

过滤后的桑黄菌丝球于50~55 ℃烘干至恒质量，研磨粉碎后过0.15 mm筛。将桑黄菌丝球粉∶水=1∶5进行均质研磨，均质完成后在桑黄菌丝球混液中加入0.2%纤维素酶，混匀后在38 ℃条件下保温水解1.5 h，将混合料在100 ℃下杀菌10 min。

将准备好的桑黄菌丝酶解滤液分别加入溶解完成的果胶及黄原胶，再依次加入复合胶、鲜柚浓缩汁、蜂蜜、柠檬酸、柠檬酸钠，后搅拌均匀，最后补水至配方规定的量；将定容后的料液加热至沸，趁热加灌入已灭菌的饮料瓶，压盖后105 ℃下杀菌10 min，冷却后得桑黄菌丝发酵饮品。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 碳源筛选

用电子天平称取一定量的葡萄糖和玉米粉，设置5个浓度梯度：4 g/L+6 g/L，6 g/L+8 g/L，8 g/L+10 g/L，10 g/L+12 g/L和12 g/L+14 g/L。玉米粉先煮沸，后用四层纱布过滤，再把滤液和一定量的葡萄糖装入有0.6 g蛋白胨，8.0 g麸皮，0.28 g MgSO4和0.6 g KH2PO4的1 000 mL的无菌玻璃容器中搅拌均匀。每个配方重复3次，分装至250 mL锥形瓶中，加入100 mL配制好的液体培养基，于121 ℃灭菌30 min。在无菌条件下冷却至室温。

1.3.2.2 氮源筛选

用电子天平称取定量的蛋白胨和麸皮，设置浓度0.3 g/L+3.0 g/L，0.4 g/L+4.0 g/L，0.5 g/L+5 g/L，0.6 g/L+6 g/L，0.7 g/L+7 g/L和0.8 g/L+8 g/L。麸皮煮沸后用四层纱布过滤，再将滤液及定量的蛋白胨装入加有4.0 g葡萄糖，5.6 g玉米粉，0.28 g MgSO4和0.6 g KH2PO4的1 000 mL的无菌玻璃容器中，搅拌均匀。每个配方重复3次，每个250 mL锥形瓶中加入100 mL液体培养基，于121 ℃灭菌30 min。在无菌条件下冷却至室温。

1.3.2.3 矿物质元素筛选

用电子天平称取定量的MgSO4和KH2PO4，5.6 g玉米粉和8.0 g麸皮，先煮沸，后用四层纱布过滤，再向滤液中装入加有4.0 g葡萄糖，0.6 g蛋白胨，以及不同浓度梯度的MgSO4和KH2PO4搅拌均匀。MgSO4+KH2PO4浓度梯度为0.6 g/L+6 g/L，0.8 g/L+8 g/L，1 g/L+10 g/L，1.2 g/L+12 g/L和1.4 g/L+14 g/L。每个配方重复3次，每个250 mL锥形瓶中加入100 mL液体培养基，于121 ℃灭菌30 min。在无菌条件下冷却至室温。

故碳源葡萄糖和玉米粉添加量为4 g/L+6 g/L，6 g/L+8 g/L，8 g/L+10 g/L，10 g/L+12 g/L和12 g/L+14 g/L；氮源蛋白胨+麸皮添加量为0.4 g/L+2.0 g/L，0.5 g/L+3 g/L，0.6 g/L+4 g/L，0.7 g/L+5 g/L和0.8 g/L+6 g/L；微量元素MgSO4和KH2PO4添加量为0.2 g/L+0.5 g/L，0.3 g/L+0.75 g/L，0.4 g/L+1 g/L，0.5 g/L+1.25 g/L和0.6 g/L+1.5 g/L，并以菌丝体干质量及总多糖含量为评价指标，试验重复3次，取平均值，确定三者最优的添加量。

1.3.3 正交试验

在前期试验基础上，判定液体培养基中碳源（葡萄糖+玉米粉）、氮源（蛋白胨+麸皮）及微量元素（MgSO4+KH2PO4）对桑黄液体菌丝生长情况存在显著影响，从单因素试验中筛选出的不同水平的葡萄糖+玉米粉、蛋白胨+麸皮、MgSO4+KH2PO4，并设置一列空白列，进行L9(34)正交试验，因素及水平设定见表1。每个处理3次重复，进行振荡培养，测定其菌丝体干质量及总多糖含量。

表1 桑黄液体培养基正交L9(34)试验因素与水平单位：g/L

1.3.4 正交试验

在前期试验基础上，白砂糖、柠檬酸及果胶和黄原胶为影响桑黄菌丝体发酵饮品的关键因素。设置白砂糖添加量为2%，4%和6%，设置柠檬酸添加比例为0.11%，0.13%和0.15%，设置果胶与黄原胶添加比例为0.08%+0.1%，0.10%+0.2%和0.12%+0.3%，进行L9(34)正交试验，因素及水平设定见表2。

表2 桑黄菌丝发酵饮品L9(34)试验因素与水平单位：%

1.3.5 指标测定方法

1.3.5.1 感官评定

感官评分标准：为了能够确定桑黄菌丝饮品质量，对制得的产品取试样置于透明玻璃杯中，在自然光下观察色泽和组织状态；用温开水漱口，品尝其口感，感受其风味为指标分五组，每组10人。感官评价由10名具有品评经验的食品专业同学进行评价，取其平均值。以100分计对产品进行感官评分鉴定，确定最佳配方。

色泽（0~30分）：色泽黄亮，质地均匀，无分层，无沉淀，稳定性好。

风味（0~30分）：特有香气纯正浓郁，柔和。

口感（0~40分）：饮品酸甜平衡，无异味或苦味，口味醇厚，协调柔和。

1.3.5.2 桑黄菌丝体干质量测定方法

桑黄菌丝体发酵液，采用150 μm筛网过滤，将菌丝体用蒸馏水抽滤3次。裁剪无纺布，并记下质量M1，将抽滤3次后的菌丝体放在无纺布上，置于DHG-9123 A电热鼓风干燥箱中55°烘干至恒重，再次称取其质量得M2，即得桑黄菌丝体干质量M0=M2-M1。

1.3.5.3 总多糖测定

总多糖测定：参照苯酚-硫酸法[11]。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖及玉米粉添加量对桑黄菌丝体干质量及总多糖含量的影响

桑黄菌丝体对于葡萄糖利用率较高，前期能满足菌丝生产的需要。而玉米粉可被桑黄菌丝缓慢分解，有益于桑黄菌丝后期多糖物质的累积。因此，在桑黄液体培养基中加入混合碳源葡萄糖和玉米粉后，随着添加比例的增加，桑黄菌丝体的干质量和总多糖含量增加。葡萄糖和玉米粉对桑黄菌丝体干质量和总多糖含量的影响如图1所示。由图1可看出，随着葡萄糖和玉米粉的添加量越来越高，桑黄菌丝体干质量先快后慢的升高过程。当葡萄糖和玉米粉的添加量10 g/L和12 g/L时，桑黄总多糖含量达到峰值为0.435 g/L，桑黄干质量为0.726 g/100 mL；葡萄糖和玉米粉用量分别为12 g/L和14 g/L时，桑黄菌丝体干质量和总多糖含量为0.392 g/L和0.732 g/100 mL。最后确定混合碳源的最佳配比是：葡萄糖和玉米粉10 g/L和12 g/L。

图1 葡萄糖及玉米粉添加量对桑黄菌丝体干质量及总多糖含量的影响

2.2 蛋白胨及麸皮添加量对桑黄菌丝体干质量及总多糖含量的影响

蛋白胨和麸皮属于有机氮化合物，常被用作微生物培养基中的氮源。此外，麸皮中含有多种维生素和糖类，且价格低廉。图2为蛋白胨及麸皮添加量对桑黄菌丝体干质量及总多糖含量的影响。结果表明，当蛋白胨和麸皮的添加量为0.6 g/L+4.0 g/L时，每100 mL液体培养基中菌丝体的干质量为0.673 g/100 mL，总多糖含量为0.49 g/L，随着添加量的增加，菌丝体的干质量先增大后减小，总多糖含量达到一定程度后有明显下降。据此分析可知，选择蛋白胨和麸皮0.6 g/L+4.0 g/L为最佳混合氮源培养基。

图2 蛋白胨+麸皮添加量对桑黄菌丝体干质量及总多糖含量的影响

2.3 MgSO4+KH2PO4添加量对桑黄菌丝体干质量及总多糖含量的影响

MgSO4和KH2PO4添加量对桑黄菌丝体干质量及多糖含量的影响见图3。由图3分析可知，桑黄菌丝体的干质量及总多糖含量随着MgSO4和KH2PO4添加量的增加呈现先增后减。当MgSO4和KH2PO4的添加量为0.5 g/L+1.25 g/L时，菌丝体的干质量为0.687 g/100 mL，总多糖含量为0.51 g/L，同比高于其他试验组。由此分析可知，MgSO4和KH2PO4的最佳添加量为0.5 g/L+1.25 g/L。

图3 MgSO4+KH2PO4添加量对桑黄菌丝体干质量及总多糖含量的影响

2.4 桑黄液体培养基工艺优化

2.4.1 正交试验结果的极差分析

由表3液体培养基优化正交试验表中的R值可知，影响桑黄菌丝干质量及总多糖含量的主次顺序皆为A＞B＞C，即葡萄糖与玉米粉添加量＞蛋白胨与麸皮添加量＞硫酸镁与磷酸二氢钾添加量。根据液体培养基配方及培养条件优化的结果分析得出，优化后的配方为A2B2C3及A2B3C3，即葡萄糖与玉米粉添加量为10 g/L+12 g/L，蛋白胨和麸皮添加量0.6 g/L+4.0 g/L（0.7 g/L+5.0 g/L）、MgSO4及KH2PO4添加量为0.6 g/L+1.5 g/L，桑黄菌丝在此配方及环境条件下生长状况良好，总多糖含量保持在较高水平。

表3 桑黄液体培养条件及培养基L9(34)试验结果分析

对试验结果进行方差分析，即在试验条件下，葡萄糖与玉米粉添加量对桑黄菌丝总多糖及菌丝体干质量影响皆显著（0.01＜p＜0.05）。蛋白胨和麸皮添加量仅对桑黄菌丝干质量影响显著（0.01＜p＜0.05），MgSO4及KH2PO4添加量对桑黄菌丝总多糖及菌丝体干质量影响皆不显著。

2.4.2 扩大性验证试验

获得优化方案A2B2C3及A2B3C3，为进一步确认其在实际生产中的可靠性与可行性，故以其为条件，即葡萄糖与玉米粉添加量为10 g/L+12 g/L，蛋白胨和麸皮添加量0.6 g/L+4.0 g/L（0.7 g/L+5.0 g/L），MgSO4及KH2PO4添加量为0.6 g/L+1.5 g/L，进行扩大性（中试）验证试验，试验重复3次，测定其菌丝干质量及总多糖含量。经试验，蛋白胨和麸皮添加量为0.7 g/L+5.0g/L，在该条件下桑黄菌丝体干质量（0.823±0.014）g/100 mL，总多糖含量为（0.493±0.018）g/L，表明该配方为较佳的桑黄液体培养配方组成。

2.5 桑黄菌丝饮品调配工艺优化

2.5.1 正交试验结果的极差分析

桑黄菌丝饮品调配L9(34)试验结果见表4，桑黄菌丝饮品方差分析见表5。

从表4桑黄菌丝饮品调配工艺的正交试验结果中的R值可知，影响其综合评分的因素主次顺序为A＞B＞C，即白砂糖＞柠檬酸＞复合胶（果胶和黄原胶）。依据综合评分的结果分析可知，优化的工艺组合均为A2B3C3，即白砂糖添加量4%、复合胶（果胶和黄原胶）添加量0.12%+0.3%、柠檬酸0.15%，制得的饮品外观、口感及风味的综合值评价最好。

表4 桑黄菌丝饮品L9(34)试验结果

对试验结果进行方差分析，表5数据显示，在试验条件下，白砂糖添加量与柠檬酸添加量对桑黄菌丝饮品的综合口感影响显著（p＜0.05），而复合胶（果胶和黄原胶）对其影响不显著（p＞0.05）。

表5 桑黄菌丝饮品方差分析

2.5.2 扩大性验证试验

获得的优化方案A2B3C3为试验第6组试验，为确认其在实际生产中的可靠性与可行性，以其为条件，即桑黄菌丝饮品调配配方为白砂糖添加量4%、复合胶（果胶和黄原胶）添加量0.12%+0.3%、柠檬酸0.15%，进行扩大性验证试验，试验重复3次，经品评后，综合得分达87.8分，试验结果均优于正交试验的6组试验组，表明该配方为较佳的桑黄菌丝饮品的适宜配方。

3 结论

对桑黄液体培养基碳源、氮源、矿物质添加量进行优化，试验结果为：蛋白胨和麸皮添加量0.7+5.0 g/L、葡萄糖和玉米粉的添加量为10.0 g/L+12.0 g/L、MgSO4及KH2PO4添加量为0.6 g/L+1.5 g/L时，菌丝干质量平均值为（0.823±0.014）g/100 mL，总多糖含量为（0.493±0.018）g/L；在对桑黄菌丝发酵饮品调配工艺过程中，通过正交试验分析得出，最优组合为白砂糖添加量4%、复合胶（果胶和黄原胶）添加量0.12%+0.3%、柠檬酸0.15%，以综合感官评价认为此配方制得的桑黄菌丝饮品，在保证口感的同时，后期贮藏验证其稳定性也较高。

通过对在最佳工艺条件下制得的桑黄发酵菌丝饮料进行感官评价，其色泽黄亮，质地均匀，无分层，无沉淀，稳定性好。特有香气纯正浓郁，柔和。饮品酸甜平衡，无异味或苦味，口味醇厚，协调柔和。在保留桑黄菌丝原有的活性功能基础上，桑黄饮品的风味独特，口感更加细腻，具有良好的市场前景。