剂量效应对输血相容性检测影响研究①

何 屹 文 韬 袁 红 （四川省医学科学院·四川省人民医院输血科，成都610072）

剂量效应指红细胞表面抗原与其特异性抗体的凝集程度与基因型密切相关，纯合子与抗体的凝集性比杂合子强，这种因纯合子、杂合子不同表现出红细胞被凝集性有强弱之分的现象称为剂量效应。确定并排除血型意外抗体是保障输血安全的重要措施。目前检测意外抗体的手段主要是进行抗体筛查和交叉配血，对抗体筛查阳性的患者，绝大多数医院采取随机选择献血员进行配血，根据配血阴性结果选择血液输注的方式，简称“盲配”。但抗原抗体的凝集反应可能受剂量效应影响，反应格局、凝集强度等不明确会存在漏检风险。因意外抗体漏检导致的输血反应时有报道，对临床输血安全提出挑战。为研究“剂量效应”对相关检测的影响，本文将四川省人民医院2016 年8 月至2019 年5 月共383 例抗体筛查阳性标本进行研究，用临床实例验证剂量效应在输血相容性检测中的影响，现介绍如下。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取 2016 年 8 月至 2019 年 5 月在四川省医学科学院·四川省人民医院进行抗体鉴定且具备特异性血型抗体标本。排除病例：①Lewis系统抗体；②Rh 系统抗D；③具有多种抗体的样本。排除原因：由于实验室使用荷兰Sanquin 试剂红细胞组上Lewis 血型系统只有Lea 抗原或Leb 抗原，无同时具备Lea和Leb两种抗原的试剂红细胞，故抗Lewis 未纳入统计，同理抗D 也未纳入。为避免干扰，样本中同时具备多种抗体的病例也未纳入统计。排除后研究对象为383 个病例，其中男性患者106 例，女性患者 277 例，年龄 0~96 岁，平均年龄（49.8±18.7）岁。

1.1.2 主要试剂与仪器 意外抗体筛查细胞为江苏力博医药生物技术股份有限公司产品；抗人球试剂、MNS 血型鉴定试剂、Rh 分型试剂为上海血液生物有限公司产品；抗体鉴定试剂红细胞组、Kidd、Duffy 血型鉴定试剂、聚乙二醇（polyethlene glycol，PEG）试剂为荷兰Sanquin 公司产品；LISS、微柱检测卡为奥森多临床诊断（英国）有限责任公司产品；所有试剂均在有效期内按使用说明书操作。奥森多临床诊断（英国）有限责任公司孵育器、卡式离心机；日本久保田KDC-2200低速离心机等。

1.2 方法

1.2.1 回顾性分析抗体筛查阳性标本进行抗体鉴定时，与含纯合子、杂合子抗原的试剂红细胞组反应结果 将抗原抗体反应分为3类：1为未发现剂量效应：抗体与纯合子、杂合子试剂红细胞凝集强度无区别；2 为存在剂量效应：抗体与纯合子、杂合子试剂红细胞均有凝集现象，但强度有区别；3 为存在剂量效应：抗体只与纯合子试剂红细胞有反应，与杂合子试剂红细胞无反应。

1.2.2 意外抗体鉴定方法 根据抗体性质选用盐水介质试管法和微柱法（抗人球介质）鉴定意外抗体。①盐水介质试管法：在一次性试管中分别加入待检血浆（或血清）2滴，再加入相应的3%抗体鉴定试剂红细胞或自身红细胞各1 滴并混匀，1 000 g 离心15 s。②微柱法（抗人球介质）：使用Ortho BioVue Coombs检测卡。向每个反应柱内加入50 μl Bliss液后，分别向反应柱内加入10 μl 3%抗体鉴定试剂红细胞，最后向反应柱内加入40 μl 待检血清或血浆。将卡于37℃孵育10 min，取出检测卡放入BioVue离心机离心5 min，观察并记录结果。

1.2.3 抗体效价测定 本研究仅对IgG 抗E 进行了效价测定。将待检血清（原液50 μl）倍比稀释后，向试管内加入50 μl 3%~5%的E 抗原为纯合子的红细胞混悬液，混匀，置于37℃孵育30 min 后用生理盐水1 000 g 离心1 min，洗涤红细胞3 次，洗涤后将红细胞浓度配制为3%，加抗人球试剂1 滴，1 000 g离心15 s，以出现1+凝集反应的最大稀释倍数为其抗体效价。

1.2.4 PEG 加强 抗E 与杂合子试剂红细胞不反应时，使用PEG 加强技术。在试管中加入待检血浆（或血清）2 滴，各管内分别加入3%E 抗原杂合子试剂红细胞、自身红细胞各1 滴并混匀，并做阴性对照。最后各管加入PEG 试剂4 滴，37℃水浴15 min后用生理盐水在1 000 g下离心1 min，洗涤细胞3次，将洗涤后的细胞配制成3%浓度的悬液，取10 μl 加入Ortho BioVue Coombs 检测卡，于专用卡式离心机离心5 min后记录结果。

1.3 统计学处理 统计不同效价抗E 对E 抗原杂合子试剂细胞漏检率。将抗E抗体效价进行常用对数转换，与漏检率进行线性相关分析。将抗体效价＜4计为低效价；抗体效价≥4计为高效价，对高、低效价两组漏检杂合子率行χ2检验，分析差异性。相关性和差异性分析均使用SPSS25.0统计学软件。

2 结果

2.1 血型意外抗体与剂量效应 通过对临床标本中意外抗体的鉴定，抗体与试剂红细胞中纯合子、杂合子的反应情况结果显示：MNS、Rh、Kidd、Duffy血型系统抗体均存在剂量效应，但受影响程度存在一定差异，从MNS、Rh、Kidd、Duffy 血型系统依次递减（表1）；抗人球介质、盐水介质分别有318 例和65例抗体鉴定，MNS、Kidd血型系统IgM 抗体在盐水介质中同样有类似以上表现（表2）；最受关注的意外抗体不与杂合子反应率显示，抗M 不与杂合子反应比例最高，达19.05%，其余依次为抗E：7.14%，抗JKa、抗 JKb：3.70%（表 3）。结果提示 MNS、Rh 血型系统受剂量影响大。表1~3 也提示MNS、Rh、Kidd、Duffy血型系统均有一定比例的抗体没有剂量效应。

表1 微柱法中不同血型系统抗体剂量效应分布［例（%）］Tab.1 Distribution of antibody dose effects of different blood groups in microcolumn method［n（%）］

表2 盐水试管法中不同血型系统抗体剂量效应分布情况［例（%）］Tab.2 Distribution of antibody dose effects of different blood groups in saline test tube method［n（%）］

表3 不同血型系统抗体剂量效应分布［例（%）］Tab.3 Distribution of antibody dose effects in different blood group systems［n（%）］

2.2 抗E 抗体效价与剂量效应 本研究以E 抗体为例，研究不同抗体效价与剂量效应的关系。结果提示，效价1 时，杂合子对抗E 的漏检率达66.67%，效价＜4时，杂合子对抗E的漏检率达40%，抗E效价与漏检率存在负相关（r=-0.799，P＜0.05，表4）。抗体效价＜4 与抗体效价≥4 两组杂合子漏检率差异有统计学意义（P＜0.01，表5）。效价≤4 的抗E 有一定比例没有剂量效应。

表4 抗E不同效价与剂量效应关系（例）Tab.4 Relationship between different titers and dose ef⁃fect of anti-E（n）

表5 不同效价抗E漏检率Tab.5 Missed detection rate with different titers of anti-E

2.3 不与杂合子凝集的抗E 使用PEG 加强 将16 例不与杂合子凝集的抗E 使用PEG 加强与试剂红细胞组反应后（方法见1.2.4）均出现了凝集。有3 例发现E 抗原阴性试剂红细胞出现弱凝集，但凝集强度明显弱于E 抗原阳性的试剂红细胞，该3 名血样患者DAT 均为阳性。结果提示，使用PEG 加强可有效增加意外抗体与杂合子细胞的阳性率。

3 讨论

剂量效应现象是指1个控制某血型抗原的等位基因为纯合子时，其红细胞上的该抗原为相应的“双剂量”；当等位基因为杂合子时，其红细胞上相应抗原为“单剂量”［1］。红细胞膜上的不同抗原剂量会对血清学结果产生影响，有些抗体与双剂量抗原和单剂量抗原会呈现不同的强度差异，与双剂量抗原红细胞反应较强，与单剂量抗原红细胞反应较弱［2］。

通过对383例抗筛阳性标本中剂量效应的分析发现，随着抗体效价降低，剂量效应导致杂合子抗原漏检率越高；在效价＜4 时，杂合子抗原漏检率明显增高，此时抗E 对杂合子漏检率高达40%。尽管抗体效价与剂量效应的漏检率存在负相关，但低效价的抗E 仍有无剂量效应的情况，分析后认为与抗体亲和力有关。亲和力高的抗体与纯、杂合子抗原结合能力差异不大，亲和力低的抗体反之。当血清中高亲和力抗体数量较少时，可以出现效价不高，但仍可与纯、杂合子抗原细胞凝集的现象。低效价、低亲和力抗体的剂量效应对输血安全的影响更大。

本研究采用临床实例直接显示了Rh、MNS、Kidd 血型均存在剂量效应，且抗M 漏检杂合子率高达19%，抗E 为6.7%，抗JKa、抗JKb为3.7%。许亚莉等［3］报道抗M、抗E 漏检率高与抗M、抗E 是临床发现频率最高的意外抗体或抗体本身特点有关。这也与通过稀释抗体来研究剂量效应得出的结论一致［4-5］。此外李晓红等［6］通过统计学方法计算得出，在试剂红细胞组株数或者抗原阳性细胞株数较少时，剂量效应可能对抗体鉴定结果造成错误。本次研究中，鉴定效价＜4 的抗体时，仅与纯合子细胞反应的现象非常明显，试剂红细胞组纯合子株数较少时，难以判断抗体种类，需使用PEG、酶处理细胞等方法，同时应全面了解患者免疫史、自身抗体情况、患者ABO 以外血型鉴定结果等，综合分析后判断。

目前，我国多数医院抗体筛查发现意外抗体后，采用“盲配”方法，即随机选择献血员进行配血，根据配血阴性结果选择血液输注。但受剂量效应影响，受血者意外抗体效价不高时，“盲配”相合的血液为假阴性概率较大。输注不合血液后发生迟发血清学反应与迟发性溶血反应比例大致为64∶36，导致的红细胞输注无效及溶血反应时有报道［7-10］。为避免剂量效应带来的危害，建议：①进行抗体及相应抗原的鉴定，建立更完善的输血相容性检测流程，即意外抗体筛查阳性，应进行抗体鉴定后使用相应抗血清筛查献血员抗原，选择抗原阴性的血液进行交叉配血并输注；②抗体筛查时，如凝集强度≤2+，建议使用PEG 加强的方法对盲配阴性的结果进行复查，可有效降低漏检率。使用PEG 加强方法配血时，应设置阴性对照。需注意患者DAT阳性，存在弱自身抗体时，PEG 方法加强后可能配血结果阳性，需判断是自身抗体还是同种抗体引起；③有条件的医院建立抗体筛查阳性患者的血清学档案，记录患者意外抗体种类。在征得患者知情同意下，医院间共享信息。减少因抗体随时间衰减至检测阈值之下或盲配带来的风险。

综上，抗体筛查阳性时，盲配不能有效避免抗体效价低时剂量效应带来的漏检，应采用更合理的输血相容性检测流程来确保输血安全。