蒜氨酸对金葡菌感染家兔免疫因子表达与吞噬细胞吞噬功能的影响①

李明强 代露露 周艳萌 韩志俊 裴天容 （遵义医科大学基础医学院微免实验室，遵义563000）

大蒜是一种古老的食药两用植物，在我国已有两千多年的种植历史，其性味生辛热、熟辛温，具有行气滞、暖脾胃、攻冷积、解毒杀虫的功效。近年大蒜及大蒜制品风靡全球，被誉为天然“药用植物黄金”。现代医学证实，大蒜素具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫功能、防治心血管疾病以及降低血脂、血糖等多种生物活性［1-3］。大蒜素主要包括二烯丙基一硫化合物（DAMS）、二烯丙基二硫化合物（DADS）、二烯丙基三硫化合物（DATS）、二烯丙基四硫化合物（DATTS）等脂溶性成分，具有特殊的刺激性［4］。大蒜素的脂溶性使大蒜素注射液配制必须使用有机溶剂、助溶剂、增溶剂，给机体带来毒副作用［5-8］；局部高浓度大蒜素的刺激性致使组织细胞损伤、形态结构与生理机能改变；导致大蒜素注射液临床使用受限，达不到预期临床效果。为此人们将目光转移到大蒜素前体物质——水溶性成分蒜氨酸，蒜氨酸与蒜酶同时使用开启了对蒜氨酸的研究进程，原理是蒜酶将蒜氨酸分解成大蒜素发挥生物学效应，现有研究报道表明，蒜氨酸与蒜酶同时使用能降低环磷酰胺对小鼠免疫功能的损伤［9］。周圆等［10］将蒜氨酸与蒜酶制备成双层包芯片，其制剂进入肠道后由蒜酶将蒜氨酸分解成大蒜素，通过肠道进入血液后发挥药效。有研究发现高浓度大蒜素引起肠黏膜炎症反应，黏膜细胞受损，使肠黏膜萎缩，杯状细胞减少［6］，尚无双层包芯片应用的研究报道。近年对蒜氨酸化学与药代动力学的研究表明，蒜氨酸在高温条件下，能发生热分解作用，形成大蒜素；蒜氨酸在体内经代谢酶的作用也能分解为大蒜素［11-13］。单独对蒜氨酸药理作用的研究较少，有研究报道用蒜氨酸对小鼠灌胃能提高小鼠免疫功能［14］。本文就金黄色葡萄球菌（后简称金葡菌）感染家兔形成脓肿，应用蒜氨酸治疗，观察蒜氨酸对家兔吞噬细胞功能与免疫因子表达的影响，以探讨蒜氨酸对细菌感染家兔免疫功能的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料 家兔购自遵义医科大学实验动物中心；蒜氨酸：农贸市场购买紫皮大蒜参照文献［15］分离提取，配制成100 mg/ml 蒜氨酸溶液，调节pH7.4；金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003 购自中国普通微生物保藏管理中心；异硫氰酸荧光素FITC购自苏州亚科科技股份有限公司（货号：3326-32-7）；青霉素购自中诺药业有限公司生产（批号：0121804114）；兔IL-2、兔 IL-7 检测试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司（批号：EDL201908164、EDL201908164）；红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司（货号：R101）。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌感染家兔模型的建立与蒜氨酸治疗 家兔60 只（清洁级），雌雄不拘，体重2~3 kg，随机分为6组，每组10只。随机抽取30只家兔采集抗凝和不抗凝血液检测正常参考值。每只家兔均于背部剪毛直径30 mm 大小，并于背部剪毛处皮下注射 9×109个/ml 金葡菌菌液 2 ml，每天观察家兔体温与局部反应，注射金黄色葡萄球菌10 d 后所有家兔脓肿形成。每组随机无菌抽取2只家兔脓汁标本0.2 ml 接种血平板、革兰染色、细菌生化鉴定。随后每天两次耳缘静脉注射治疗，第1组为阴性对照组，注射无菌生理盐水0.5 ml；第2组为阳性对照组，注射 8×105U/ml 青霉素 0.1 ml；第3组注射100 mg/ml 蒜氨酸溶液 0.1 ml，第 4 组注射 10 mg/ml蒜氨酸溶液0.5 ml，第5组注射10 mg/ml 蒜氨酸溶液0.1 ml，第6组注射1 mg/ml 蒜氨酸溶液0.5 ml。治疗后24 h、72 h、7 d 每只家兔均采集抗凝血、不抗凝血液各1支。抗凝血立即检测吞噬细胞吞噬百分率，未抗凝血液分离血清，-80℃保存用于检测抗金葡菌抗体、IL-2和IL-7水平。

1.2.2 吞噬细胞吞噬百分率检测 参照文献［16］制备荧光素标记细菌，用无菌PBS 洗下金葡菌18 h斜面培养物，水浴煮沸10 min，4 000/rmin 离心20 min，沉淀用PBS 洗涤3次。pH9.5碳酸盐缓冲液配成浓度为 9×109个/ml 的悬液，取该菌液 10 ml 加入二甲基亚砜配成 10 mg/ml 的 FITC 溶液 50 μl，使FITC 在菌液中的终浓度为50 μg/ml。混匀置37℃1 h，4%多聚甲醛固定 10 min，4 000/rmin 离心20 min，沉淀经 PBS 洗涤 3 次，用 PBS 配成浓度为9×109个/ml 细菌悬液，流式细胞仪检测细菌的FITC标记率，避光保存于4℃备用。

吞噬百分率检测：10 ml 溶血剂置刻度离心管，加入兔抗凝血 2 ml 混匀，10 min 后 1 000/rmin 离心10 min，沉淀用 PBS 洗涤 3 次，用 0.5 ml PBS 分散细胞，加入1×109个/ml浓度的FITC标记的金黄色葡萄球菌 0.2 ml，混匀置 37℃ 30 min，1 000/rmin 离心10 min，沉淀经 PBS 洗涤 3 次，用 400 μl PBS 分散细胞，流式检测。

1.2.3 ELISA 法检测IL-2、IL-7 水平 各标准孔加入不同浓度标准品溶液50 μl，在样品孔中加入样品稀释液 40 μl 和血清样品10 μl，在标准与样品各孔中加入酶标记抗体试剂100 μl，封板置37℃60 min。取出反应板，洗涤时设置空白对照孔，同时进行后续操作。倒掉孔中液体，加满洗涤液，静止30 s后倒掉洗涤液，如此洗板5次，拍干反应板。各孔加入显色液A 50 μl，显色液B 50 μl，混匀置37℃ 避光显色15 min。各孔加入终止液50 μl，上机检测。

1.2.4 金葡菌抗体检测

1.2.4.1 金葡菌菌液制备 金葡菌18 h 肉汤培养物，接种于克氏瓶固体斜面培养基，培养24 h，用生理盐水洗下菌苔，100℃水浴煮沸1 h，4 000/rmin离心20 min，沉淀用生理盐水洗涤3 次，生理盐水配制成1×108个/ml浓度菌液备用。

1.2.4.2 抗体检测 小试管放试管架上一排12管，第1管生理盐水0.9 ml，第2至12管0.5 ml生理盐水。第1 管加入待检血清0.1 ml，混匀后吸取0.5 ml加入第2管，第2管混匀后吸取0.5 ml加入第3 管，如此倍比稀释至 11 管，混匀后吸取 0.5 ml 丢掉，第12管为对照。每管加入1×108个/ml金葡菌菌液0.5 ml混匀，置37℃、24 h观察结果。

1.3 统计学处理 采用Excel 录入数据，SPSS17.0软件进行统计分析。数据经正态性检验后，计量资料采用表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 脓汁标本细菌培养鉴定结果 12 个浓汁标本划线接种血平板，经37℃培养24 h均有单一的金黄色菌落，菌落周围有透明溶血环；涂片革兰染色镜下为革兰阳性葡萄球菌，血浆凝固酶试验、甘露醇发酵均为阳性。

2.2 吞噬细胞吞噬百分率 用流式细胞仪检测样本，以FSC-A 为横坐标，SSC-A 为纵坐标，设置门R，门内包含了98%以上的检测颗粒，总共收集R门内1×105个颗粒进行分析，得到吞噬细胞吞噬细菌的流式分析图，如图 1（A 为流式条件 R 门，B 为金葡菌经FITC 染色标记流式图，标记率为99.77%，C 为正常家兔吞噬百分率流式图，D 为阴性对照组72 h 吞噬百分率流式图，E 为青霉素组72 h 吞噬百分率流式图，F~I分别为蒜氨酸治疗3~6组治疗72 h吞噬百分率流式图）。

图1 流式分析图Fig.1 Flow cytometry analysis diagram

实验前采集正常家兔血液检测吞噬百分率为正常参考值（81.36±3.12）%。各组吞噬细胞吞噬百分率结果见表1，经方差分析差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。正常家兔的吞噬百分率均显著高于各实验组（P＜0.01）。阴性对照组吞噬百分率均显著低于阳性对照组和蒜氨酸治疗组（P＜0.01）。阳性对照组随着治疗时间延长吞噬百分率显著升高（P＜0.01）；阳性对照组各时间点的吞噬百分率均低于蒜氨酸治疗组和正常参考值（P＜0.01），具有显著统计学意义。不同浓度的蒜氨酸治疗组24 h 各组间吞噬百分率比较均无显著差异（P＞0.05）；治疗48 h 第3、4 组显著高于第5、6 组（P＜0.01）；治疗7 d各组均明显升高，与正常参考值比较差异无统计学意义（P＞0.05），但与阳性对照组比较差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。

表1 吞噬细胞吞噬百分率（，%）Tab.1 Devour percent of phagocytes（，%）

表1 吞噬细胞吞噬百分率（，%）Tab.1 Devour percent of phagocytes（，%）

Note：Negative treatment group was significantly lower than the rest of the group，P＜0.01；penicillin treatment group is significantly higher than the negative treatment group，significantly lower than of alliin in treatment group，P＜0.01.

7 d 35.40±2.75 62.66±3.62 81.44±3.92 79.74±3.39 81.44±3.64 78.64±3.57 Groups Negative treatment Penicillin treatment Allicin treatment Injection dose NS，0.5 ml 800 000 U/ ml，0.1 ml 100 mg/ ml，0.1 ml 10 mg/ ml，0.5 ml 10 mg/ ml，0.1 ml 1 mg/ ml，0.5 ml 24 h 36.98±2.92 49.82±2.05 66.09±3.28 66.27±3.23 66.13±3.30 66.43±3.25 72 h 35.11±2.92 56.26±2.63 73.99±3.12 72.59±3.44 68.29±3.11 67.89±3.62

2.3 IL-2 水平 采集正常家兔检测IL-2 参考值为32.22±22.02，IL-2 检测结果见表 2，各组 IL-2 结果经方差分析差异有统计学意义（P＜0.01）。正常家兔血清中IL-2 显著低于各实验组，差异有统计学意义（P＜0.01）。阴性对照组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），显著低于蒜氨酸治疗组，差异有统计学意义（P＜0.01）。阳性对照组血清中IL-2 显著高于正常家兔参考值（P＜0.01），与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），显著低于蒜氨酸治疗组（P＜0.01）。蒜氨酸各治疗组血清IL-2进行组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），24 h IL-2 含量显著高于 72 h 和 7 d（P＜0.01）；72 h 与 7 d差异无统计学意义（P＞0.05）；7 d 蒜氨酸各组治疗均显著高于阴性对照组、阳性对照组和正常家兔参考值（P＜0.01）。

表2 细胞因子检测结果（pg/ml）Tab.2 Detection of cytokines results（pg/ml）

2.4 IL-7 水平 采集正常家兔检测IL-7 参考值为28.28±16.57，IL-7 检测结果见表 2，各组 IL-7 结果经方差分析差异有统计学意义（P＜0.01）。正常值显著低于各治疗组（P＜0.01）。阴性对照组IL-7 显著低于阳性对照组和蒜氨酸治疗组（P＜0.01）。阳性对照组显著高于阴性对照组（P＜0.01）；显著低于蒜氨酸治疗组（P＜0.01）。蒜氨酸治疗组72 h第3、4组显著低于第5、6组（P＜0.01）；蒜氨酸各治疗组7 d显著高于阴性对照组、阳性对照组和正常家兔参考值（P＜0.01）。

2.5 家兔抗金葡菌抗体效价 各组抗体结果经方差分析差异有统计学意义（P＜0.01）。阴性对照组结果为26±8.4，显著低于各治疗组（P＜0.01）；阳性对照组结果为112.73±46.71，显著高于阴性对照组（P＜0.01），显著低于蒜氨酸各组治疗（P＜0.01）。蒜氨酸各组治疗结果依次为1 047.27±97.357、1 047.27±97.357、1 047.27±334.229、1 047.27±334.229，蒜氨酸各治疗组组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

脓肿为常见感染类型之一，金葡菌是引起化脓性感染常见致病菌，本研究采用金葡菌感染家兔脓肿模型，经过皮下注射金葡菌，家兔均有脓肿形成，脓汁标本均培养、鉴定为金葡菌，成功建立家兔脓肿模型。

本研究通过金葡菌感染建立家兔脓肿模型，探讨蒜氨酸对免疫功能的调节作用。在抗感染免疫中吞噬细胞是第一道防线，也是抗感染免疫的效应细胞，发挥着积极有效的抗感染作用。IL-2 在调节机体免疫应答方面发挥着至关重要的作用，也是具有代表性的免疫应答调节因子之一。而IL-7 是一种多潜能的细胞因子，在免疫系统中IL-7 有不可替代的作用。IL-7不仅是正常T、B 淋巴细胞分化成熟过程中的重要因子，还是多潜能干细胞和髓系前体细胞的移动因子，在机体免疫细胞应激、成熟、释放过程中发挥着重要作用。同时，IL-7 还能促进T 细胞功能、诱导单核巨噬细胞表达多种细胞因子。抗体是免疫细胞分泌的效应因子，可显示蒜氨酸对患病机体免疫应答调节效果［17-20］。因此，本研究通过检测金葡菌感染的家兔体内吞噬细胞的吞噬百分率、IL-2、IL-7 和抗金葡菌抗体，探讨蒜氨酸对患感染性疾病家兔免疫功能的调节作用。

正常家兔的吞噬细胞吞噬百分率显著高于各实验组（P＜0.01），金葡菌外毒素对吞噬细胞有显著的毒性作用［20］。阴性对照组吞噬百分率显著低于各治疗组（P＜0.01），青霉素进入体内杀死大量金葡菌，减少外毒素分泌，蒜氨酸能增强吞噬细胞吞噬和杀菌功能［14，21］，各治疗组吞噬细胞吞噬功能均有一定程度恢复。青霉素组随着治疗时间延长吞噬百分率显著升高（P＜0.01），表示随着时间推移体内金葡菌及其毒素减少和消失，吞噬细胞吞噬功能逐渐恢复。蒜氨酸治疗组吞噬百分率显著高于青霉素治疗组（P＜0.01），蒜氨酸分子有不饱和双键结构，具有抗氧化作用，能提高吞噬细胞抵抗金葡菌外毒素的毒性伤害［21］；同时蒜氨酸与细胞膜表面蛋白结合，改变膜表面蛋白空间结构，阻止金葡菌外毒素与受体结合，使细胞免受金葡菌外毒素的伤害，蒜氨酸治疗组的吞噬细胞得到有效保护；同时IL-7 高表达加快吞噬细胞成熟、释放。72 h 蒜氨酸治疗第3、4 组明显高于第5、6 组，可能是因低浓度蒜氨酸杀菌效果欠佳，体内金葡菌继续增殖产生毒素，抑制了吞噬细胞的活性。经过蒜氨酸7 d 治疗，吞噬率与正常对照无显著性差异（P＞0.05），显示蒜氨酸具有较好恢复吞噬细胞吞噬功能的作用。

各治疗组的IL-2 显著高于正常家兔（P＜0.05），是机体被炎症因子刺激所致［22］。实验组中，蒜氨酸治疗组IL-2 显著高于阴性对照组和阳性对照组，表明蒜氨酸能提高IL-2 表达，提高机体免疫应答能力。蒜氨酸治疗组间无显著性差异（P＞0.05），说明本文蒜氨酸使用浓度范围内没有剂量依赖关系；24 h 与72 h、7 d 比较均显著降低（P＜0.01），随着时间推移IL-2 较快降低；7 d 蒜氨酸治疗各组均显著高于阴性对照组和阳性对照组，显示IL-2 能维持一段时间较高水平。

正常对照组IL-7 显著低于各实验组（P＜0.01），差异均有显著统计学意义，是金葡菌感染所致炎症刺激的结果，与文献报道相符［23］。阴性对照组和阳性对照组IL-7 显著低于蒜氨酸治疗组（P＜0.01），表明蒜氨酸进入机体可提高IL-7 表达。72 h 第5、6 组显著高于第3、4 组，显示高剂量蒜氨酸治疗组的IL-7 高表达维持时间短，低剂量蒜氨酸治疗维持时间长，可能与金葡菌在机体内增殖有关。7 d蒜氨酸治疗组间均无显著性差异（P＞0.05），显著高于阴性对照组和阳性对照组（P＜0.01），显示IL-7 在机体维持一段时间较高水平。

家兔抗金葡菌抗体，阴性对照组显著低于阳性对照组，一方面阴性对照组未进行有效治疗，机体极度衰竭，影响免疫应答，产生抗体较少；同时体内还存在抗原物质与之结合，消耗抗体所致抗体效价较低。青霉素组显著低于蒜氨酸治疗各组（P＜0.01），是蒜氨酸调节免疫应答的结果，与文献报道蒜氨酸小鼠灌胃提高脾细胞溶血空斑数相吻合［14］。

综上所述，蒜氨酸进入机体后对吞噬细胞具有保护作用，增强吞噬细胞吞噬杀菌能力；提高IL-2、IL-7与抗体水平，加快免疫细胞的成熟释放，调节机体免疫应答，增强机体免疫防御功能，消灭体内的病原微生物。