青石止痒软膏对特应性皮炎小鼠信号素3A/神经生长因子及相关信号分子的影响

邓宇童 蔡玲玲 任雪雯 李雪 胡博 冯蕙裳 杭小涵 赵欣楠 于心荟 李元文

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种以湿疹样皮疹、瘙痒、局部干燥等症状为特征的慢性、复发性、炎症性皮肤病[1]。近年来，AD在中国的发病率增长迅速。目前相关研究发现，新生的表皮神经纤维与AD的发病关系密切[2-4]。表皮神经纤维的生长受到神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和信号素3A(semaphorin3A,Sema3A)双向调控，同时还有其他相关因子共同参与。当AD发病时皮肤屏障被破坏，表皮新生神经纤维密度增加，而通过调控Sema3A/NGF及相关分子水平，可以减少AD病患皮损部位新生表皮神经纤维的密度，减轻皮肤炎症，改善AD临床症状[5]。本团队通过前期临床观察发现，应用青石止痒软膏治疗湿疹[6-8]、银屑病[9-10]、神经性皮炎[11-14]及AD等炎症性皮肤病疗效显著，相关作用机制研究有待完善。故本研究以不同浓度青石止痒软膏干预2，4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorbenzene，DNCB)诱导的小鼠AD模型，观察皮损症状评分、组织病理学改变、Sema3A/NGF及其相关信号分子表达的情况，从分子水平探讨青石止痒软膏治疗AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性BALB/C小鼠56只，8周龄，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物质量合格证号：110324201103138756；实验动物生产许可证号：SCKX(京)2019-0010。于北京中医药大学东方医院SPF级动物房适应性喂养1周后开始实验。

1.2 实验药物、主要试剂及仪器

阳性对照试剂为丁酸氢化可的松(尤卓尔，天津药业集团有限公司，批号：20061033)；阴性对照试剂为青石止痒软膏所用基质软膏，由北京中医药大学东方医院皮肤科外治室制备，将橄榄油、蜂蜡按照10∶1配置而成；不同浓度青石止痒软膏由北京中医药大学东方医院皮肤科外治室制备，将青黛20 g、煅炉甘石60 g、煅石膏30 g、苦参30 g、黄柏30 g加8倍量70%乙醇，加热回流提取，离心过滤，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩为1g生药/mL提取液浓度的浸膏，冰片10 g趁热加入浓缩液中混合均匀，闷润30分钟，过滤，蒸干后加入基质软膏，配制含药量不同的青石止痒高浓度软膏(0.36 g/g)、中浓度软膏(0.18 g/g)、低浓度软膏(0.09 g/g)。

Trizol(美国Invitrogen公司，批号：326411)；氯仿、异丙醇(南京化学试剂有限公司，批号：20180907、2020120)、DEPC(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20210125)；cDNA第一链合成试剂盒、One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II(日本TaKaRa公司，批号：AJE1627A、AJE1687A)；rabbit Anti-GAPDH、羊抗兔IgG-HRP(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20210121、20210115)；Rabbit Anti-Semaphorin 3A(美国abcam，批号：GR295523-1)；Rabbit Anti-PLPAK1(武汉三鹰，批号：00069245)；NGF、IL-31 ELISA试剂盒(美国Raybiotech，批号：409210572、521211755)；NT-4 ELISA试剂盒(美国RbD Systems，批号：0730210209)；H.E染色试剂盒、中性树胶封片剂(北京中科万邦生物科技有限公司，批号：RY-0002、FP-0001)；丙酮(北京化工厂，批号：20190801)；DNCB(天津光复精细化工研究所)；硫化钠(福晨化学，批号：20190827)。

ST16R高速冷冻离心机(美国 Thermo Sorvall)；Spectramac M3多功能酶标仪(美国 MD)；XW-80A涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；荧光定量PCR循环仪、普通梯度PCR仪(美国ABI)；UV-2450紫外光度仪(日本 SHIMADZU)；电泳仪(美国 Bio-rad)；THZ-312台式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司)；G：BOXChemiXR5凝胶成像系统(英国 SYNGENE)；JT-12S脱水机、JB-P7包埋机(武汉俊杰电子有限公司)。

1.3 造模及分组

将56只小鼠适应性喂养1周后，全部予脱毛处理，脱毛方法为：用电推器及8%硫化钠溶液对小鼠进行实验部位脱毛，于腹部去毛，面积约为1 cm×2 cm，背部去毛面积约2 cm×3 cm。脱毛后，以随机数字表法将56只小鼠随机分为空白组8只，实验组48只。结合参考文献[15]及团队相关实验经验[16]以DNCB丙酮溶液对实验组小鼠进行特应性皮炎造模，造模方法略有调整，具体方法为：造模第一天，于腹部脱毛处涂7%的DNCB丙酮溶液致敏，3天后于同一位置进行第二次致敏；造模第8天，于背部涂0.5%的DNCB丙酮溶液进行激发，后每5天激发一次，连续激发6次。

造模成功后，再次以随机数字表法将实验组48只特应性皮炎模型小鼠随机分为模型组、阳性对照组、阴性对照组、青石止痒高浓度组、青石止痒中浓度组、青石止痒低浓度组，每组8只。

1.4 干预方法

造模完成后，各组均予常规喂养。空白组、模型组不予任何干预措施；阳性对照组于背部皮损部位涂丁酸氢化可的松乳膏，每日2次；阴性对照组于背部皮损部位涂基质软膏每日2次；青石止痒高、中、低浓度组于背部皮损部位涂分组对应浓度的青石止痒软膏，每日2次。各组用药参考指尖单位标准，每次用药按照1指尖单位/2 cm2药量外用，连续用药7天。用药期间若小鼠毛发生长则用4%硫化钠溶液外涂补充脱毛。

1.5 皮损评分[17]

观察记录除空白组外各组小鼠皮损部位皮损评分，参考临床特应性皮炎积分(scoring atopic dermatitis,SCORAD)指数标准，在取材前，对皮损严重程度进行评分：包括红斑、鳞屑、水肿/丘疹、表皮剥脱，分为无(0分)、轻(1分)、中(2分)、重(3分)4个等级，各症状分级之间可记半级分数即0.5分、1.5分、2.5分。特应性皮炎总积分(表示小鼠AD严重程度)记为各项评分总和，区间为0～12分。

1.6 取材

药物干预结束后1天，对小鼠予4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射进行麻醉，取实验组背部造模部位皮肤及空白组同部位皮肤后予颈椎脱臼处死。将2 cm×1 cm大小皮肤组织于4%多聚甲醛中固定；将1 cm×1 cm大小皮肤组织3块，分装后于液氮速冻，置于-80℃冰箱冻存备用。

1.7 皮损病理切片观察

取固定于4%多聚甲醛中的皮肤组织，进行常规脱水、包埋、切片等操作后，予HE染色。用全自动数字病理切片扫描仪对病理切片进行扫描，以K-Viewer软件观察皮损部位组织病理学变化。

1.8 皮肤组织匀浆检测

取冻存于-80℃冰箱的皮肤组织进行相关分子检测。

以实时荧光聚合酶链式扩增反应定量法检测皮损中microRNA-145相对表达水平，从每组中随机抽取4只小鼠的皮肤组织进行检测。采用Trizol试剂提取皮损组织总RNA，测定浓度后制备cDNA进行反转录。扩增程序为：95℃，预变性5分钟；共40个PCR循环(95℃变性15秒；60℃退火20秒；72℃延伸40秒)。荧光定量PCR循环仪进行定量，每个样本基因做3个复孔；通过2-△△ct法计算microRNA-145相对表达量。microRNA-145引物序列：上游引物5′-CGCGATTCCTGGAAATACTG-3′,下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。U6序列：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，94bp。

以蛋白免疫印迹法检测Sema3A、P21活化激酶(p21-activated kinase,PAK)水平。对皮损组织蛋白提取、定量后，配置分离胶、浓缩胶每孔上样适量(30 μg)蛋白，90V电泳后进行转膜，转膜结束后，取出NC膜并作好标记，用TBST洗膜5分钟×3次后以5%脱脂奶封闭，摇床振荡2小时。封闭后再次以TBST洗膜5分钟×3次后将膜放入含一抗(Semaphorin 3A，1∶1 000；PLPAK1，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000)的平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜。吸弃一抗，洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室温摇床振荡反应2小时。ECL显色后曝光、显影。使用G：BOX chemiXR5成像。使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。

以酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测白细胞介素31(interleukin-31，IL-31)、NGF、神经生长因子4(neurotrophin-4,NT-4)含量。采用BCA试剂盒检测皮损组织细胞裂解液蛋白浓度，按照说明书完成操作后立即在酶标仪450 nm读数。采用Sigmaplot 12.0软件计算浓度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组AD小鼠皮损表现及评分比较

取材前观察各组小鼠背部皮肤情况，空白组小鼠未见皮损；模型组、阴性对照组小鼠皮肤存在不同程度的红斑、鳞屑、表皮剥脱、抓痕、结痂等皮损；阳性对照组及青石止痒各浓度组，上述皮损较模型组、阴性对照组明显减少。皮损评分结果显示，治疗后模型组与阴性对照组SCORAD评分无明显统计学差异(P>0.05)；与模型组、阴性对照组相比，阳性对照组及青石止痒各浓度组SCORAD评分降低，皮损症状改善(P<0.05)；阳性对照组与青石止痒中浓度组相比，二者皮损评分无统计学差异(P>0.05)，青石止痒高、低浓度组皮损评分高于阳性对照组(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组AD小鼠SCORAD评分结果比较

2.2 各组AD小鼠皮肤组织病理学变化比较

空白组：角质层连续，角质形成细胞排列整齐，连接紧密，无明显炎症细胞浸润；模型组：棘层、颗粒层增厚，可见角化过度及角化不全，真皮层有大量淋巴细胞浸润，局部水肿明显，提示慢性炎症；阴性对照组：与模型组表现基本一致；阳性对照组：角质层较薄，偶可见角化过度，与模型组相比棘层变薄，少量炎症细胞浸润，角质形成细胞排列整齐，无明显水肿；青石止痒各浓度组：与模型组相比棘层变薄，真皮层淋巴细胞浸润减少，细胞间水肿较轻。见图1。

2.3 各组AD小鼠皮肤组织microRNA-145表达水平比较

与空白组相比，治疗后模型组、阴性对照组、青石止痒高、低浓度组的microRNA-145表达水平降低(P<0.05)；与模型组相比，青石止痒高、中浓度组的microRNA-145表达水平升高(P<0.05)；与阳性对照组比较，青石止痒各浓度组microRNA-145表达水平无明显统计学差异(P>0.05)。结果见表2。

表2 各组AD小鼠皮肤组织microRNA-145表达水平比较

2.4 各组AD小鼠皮肤组织Sema3A、PAK蛋白表达水平比较

与空白组相比，治疗后模型组、阴性对照组、青石止痒高、低浓度组皮肤Sema3A蛋白表达水平降低(P<0.05)，PAK蛋白表达水平升高(P<0.05)；与模型组相比，阴性对照组在两种蛋白表达水平上无统计学差异(P>0.05)；与模型组、阴性对照组相比较，阳性对照组、青石止痒中、低浓度组Sema3A蛋白表达水平升高(P<0.05)，PAK蛋白表达水平降低(P<0.05)；与阳性对照组相比，青石止痒高浓度组PAK蛋白表达水平升高(P<0.05)，阳性对照组与青石止痒中、低浓度组的Sema3A蛋白、PAK蛋白表达水平无明显统计学差异(P>0.05)。结果见图2、表3。

注： A 空白组；B 模型组；C 阳性对照组；D 阴性对照组；E 青石止痒高浓度组；F 青石止痒中浓度组；G 青石止痒低浓度组。

注：A 空白组；B 模型组；C 青石止痒中浓度组；D 青石止痒高浓度组；E 青石止痒低浓度组；F 阴性对照组；G 阳性对照组。

表3 各组AD小鼠皮肤组织Sema3A、PAK蛋白表达比较

2.5 各组AD小鼠皮肤组织NGF、NT-4、IL-31含量比较

与空白组相比，治疗后模型组、阴性对照组及青石止痒高浓度组皮肤NGF含量升高(P<0.05)，模型组NT-4含量升高(P<0.05)，模型组、阴性对照组IL-31含量升高(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、青石止痒各浓度组NGF、NT-4、IL-31含量均降低(P<0.05)，阴性对照组NT-4、IL-31含量降低(P<0.05)；与阳性对照组相比、阴性对照组，青石止痒高浓度组NGF含量升高(P<0.05)，阴性对照组、青石止痒低浓度组IL-31含量升高(P<0.05)，青石止痒中浓度组NGF、NT-4、IL-31含量与阳性对照组相比无显著差异(P>0.05)。结果见表4。

表4 各组AD小鼠皮肤组织NGF、NT-4、IL-31含量比较

3 讨论

AD作为皮肤科临床常见疾病，其病因及发病机制复杂，至今未能明确。目前学界主要认为AD的发病原因是环境因素作用于遗传易感性个体从而导致一系列免疫失调所致[18]，这与中医“两虚相得”的认识一致。青石止痒软膏原名甘石青黛膏，源自已故名老中医金起凤教授经验方，后经李元文教授[19]根据几十年的临床应用进行优化改良而得。方中重用炉甘石收湿止痒敛疮为君；青黛泻火解毒，凉血燥湿，与燥湿生肌的煅石膏相伍为臣；黄柏、苦参为佐以增强燥湿止痒之力；冰片解毒疗疮为使，诸药合用共奏清肝泻火，燥湿止痒之功。青石止痒软膏现作为北京中医药大学东方医院院内制剂被广泛应用于辨证为湿热证或肝郁化火证的炎症性皮肤病，疗效显著。其治疗AD的分子机制还有待完善。

本研究显示，DNCB诱导造模后，模型组小鼠出现红斑、鳞屑、表皮剥脱等皮损，组织病理学可见真皮层有大量淋巴细胞浸润，局部水肿明显棘层、颗粒层增厚，角化过度及角化不全的表现，提示造模成功。用药7天后，青石止痒各浓度组以及阳性对照组在皮损评分与组织病理学表现上较模型组明显改善，提示青石止痒软膏对AD疗效明确。

研究发现，神经内分泌—免疫—皮肤系统下属的神经营养因子家族所包含的NGF、脑源性神经因子、神经生长因子3及NT-4等因子在促进神经生长方面扮演重要角色，是神经元和角质形成细胞的生长因子，具有抗凋亡、参与神经递质的释放以及调控皮肤炎症的作用[20-21]。而同样由角质形成细胞表达的Sema3A作为神经排斥因子，则具有抑制神经生长的作用，与NGF等因子共同支配表皮神经纤维的生长，起到双向调节的作用。有研究发现，当皮肤屏障破坏后，表皮神经正常生长受影响，表现为表皮神经的密度增加[22]。相关研究已发现，在患有AD的人类[23-25]和小鼠皮肤活检[26]中观察到NGF高于正常表皮表达，其他因子如NT-4在AD患者中表达也有增加[27]，与之相对的Sema3A的表达则会减少[28]。应用神经生长因子抑制剂[29]或Sema3A软膏[30]可以有效干预AD的发展，其他干预手段也可以通过对Sema3A/NGF相关分子水平产生影响从而治疗AD[31-32]。

本研究显示，阳性对照组以及青石止痒中、低浓度组Sema3A表达水平高于模型组；阳性对照组、青石止痒各浓度组NGF、NT-4含量低于模型组。而与空白组比较，青石止痒高、低浓度组分子水平上仍存在差异，未恢复到正常水平，提示不同浓度药物治疗效果可能存在差异，考虑可能与药膏浓度、透皮吸收度以及疗程等因素相关，具体还需进一步研究。

此外本研究结果显示，与空白组相比，模型组microRNA-145表达降低，PAK表达增多，IL-31含量增加；经7天用药后，阳性对照组及青石止痒中浓度组microRNA-145表达上调，PAK表达减少，阳性对照组及青石止痒各浓度组IL-31含量减少，与空白组相比无显著差异。microRNA-145是调控Sema3A蛋白基因表达的重要靶向micro RNA，当microRNA-145上调时，mRNA以及蛋白质水平上的Sema3A都会出现过度表达[33]。PAK是Rac1的效应结合蛋白，有研究表明PAK对Sema3A及其诱导的神经塌陷反应有一定的抑制作用[34]，因此推测其可能与AD有潜在联系。除此之外，还有许多因子可能影响到AD患者表皮神经纤维的生长。有研究报道AD患者皮肤瘙痒部位的IL-31含量高于正常皮肤[35]，这可能与IL-31诱导神经元的生长，从而导致皮损部位神经密度增加有关[36]。有研究也证实了抗IL-31可显著抑制AD小鼠模型的瘙痒症状[37]。

综上，青石止痒软膏一方面可以改善AD皮损症状以及组织病理学变化，另一方面在分子层面，可能是通过降低NGF、NT-4的水平，并通过增强microRNA-145基因表达，从而提高Sema3A蛋白表达水平，同时抑制PAK蛋白表达，从而降低皮损部位新生表皮神经纤维密度，对AD起到积极的治疗作用。此外，青石止痒软膏还可以通过降低皮损部位IL-31分子水平，进一步减少新生表皮神经纤维对皮损部位的影响。