牵正散合大补阴丸对蛋白酶抑制因子I诱导的帕金森病体外细胞模型大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞的增殖和凋亡的影响

黄松丽 张琳婧 张秋艳 王媛媛 梁羽茜 胡秀华

帕金森病是一种中枢神经性疾病，神经元的丢失与该病的发生发展密切相关。中医药可能通过针对不同致病因素的多重作用保护存活的多巴胺神经元[1]。牵正散和大补阴丸是中医临床常用的两个方剂，柴原等[2]研究表明牵正散和大补阴丸及其合方对小鼠脑神经有保护作用。此外，课题组前期研究发现6 μmol/L蛋白酶抑制因子I(proteasome inhibitor I，PSI)诱导大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞可成功复制帕金森病体外细胞模型，而一定浓度的牵正散水煎剂能够改善PSI对该细胞的抑制作用[3]。本研究通过PSI对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheochromocy-toma cells，PC12)进行诱导，复制帕金森病体外细胞模型，研究牵正散合大补阴丸水煎剂对该细胞模型细胞增殖、凋亡及总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量的影响，检测牵正散合大补阴丸水煎剂对泛素/蛋白酶体途径中相关因子TBP1-19和PA28α蛋白表达的影响，确定牵正散合大补阴丸对帕金森病体外细胞模型的影响及作用机制，为中医临床治疗提供新思路和可靠依据，并为合方用药提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株

大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheochromocy-toma cells，PC12)，编号：3111C0001CCC000024，购于北京协和医学院基础学院细胞中心。该细胞为疏松贴壁细胞，以多角形为其形态特性，85% RPMI 1640和10% 胎牛血清以及5%马血清的完全培养基为其培养条件，于恒温恒湿(37℃，5%CO2)培养箱中培养。

1.2 药物制备

PSI(德国默克集团，批号：539160)粉末溶于DMSO中，配制为2 mmol/L的储存浓度，于-20℃冰箱避光分装保存。

大补阴丸、牵正散两方剂药物购于北京同仁堂药业有限公司。依据常规煎煮方式将大补阴丸(熟地黄18 g、龟板18 g、黄柏12 g、知母12 g)水煎浓缩并经过无菌处理，以2 g/mL的水煎剂浓度4℃冰箱中保存备用(长期则保存于-20℃冰箱)。牵正散(白附子9 g、白僵蚕9 g、全蝎9 g)水煎剂的制备方式和储存浓度与之相同[3]。

1.3 主要试剂

Annexin-FITC/PI双染试剂盒(江苏凯基生物科技有限公司，批号：KGA106)，SOD检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号：R22261)，TBP1-19(美国Enzo公司，批号：03051248)，PMSE1多克隆抗体(又名：PA28α，美国PROTEINTECH GROUP公司，批号：10543-1-AP)，β-actin(美国PROTEINTECH GROUP公司，批号：20536-1-AP)，羊抗小鼠IgG-HRP(北京索莱宝生物科技有限公司，批号：SE131)，羊抗兔IgG-HRP(北京索莱宝生物科技有限公司，批号：SE134)。

1.4 分组处理

根据MTT法计算出对PC12细胞抑制率为0%、25%(即IC0、IC25)时的牵正散水煎剂的浓度分别为0.20 mg/mL(下文为Q0)、12.29 mg/mL(下文为Q25)，大补阴丸水煎剂的浓度分别为0.81 mg/mL(下文为D0)、4.49 mg/mL(下文为D25)。据此将实验分组设置为9组：模型组；模型加单方组分为PSI+Q0组，PSI+Q25组和PSI+D0组，PSI+D25组；PSI加合方组分为P+D25+Q25组，P+D25+Q0组和P+Q25+D0组；空白对照组。模型组给药为6 μmol/L PSI[4]，PSI加药组即6 μmol/L PSI及上述各组对应浓度药物共同处理，空白对照组予等量培养液培养。每组设三个平行样本。

1.5 流式细胞术检测凋亡

将PC12细胞按每孔6×104个/mL的密度接种于6孔细胞培养板中，培养24小时后按照1.4分组及给药处理，继续培养48小时，将悬浮在培养液中的PC12细胞收集于离心管中离心(2 000 r/min，5分钟)后加入预冷的PBS吹打混匀；用不含EDTA的胰酶将贴壁生长的PC12细胞消化收集于离心管中离心，加入预冷的PBS吹打混匀；将两离心管中的细胞混合，重悬离心后用PBS洗涤一次。用500 μL Binding buffer吹打混匀PC12细胞后，避光加入5 μL Annexin-FITC混匀，再加入5 μL Propidium Iodide，室温避光环境下放置10分钟后进行流式细胞仪检测。

1.6 NBT核黄素比色法检测细胞上清液SOD含量

细胞培养、接种方式、分组及给药处理均同1.5，各组细胞继续培养48小时，保留细胞上清液储存于-20℃冰箱备用。设置分组，根据说明制备工作液，于EP管中加入各组分混匀，随后光照对照组和待测样品组分别加入96孔板中。将空白对照组EP管单独置于暗处避光反应；96孔板暴露在4 000 LX日光灯下反应20分钟后，将空白对照组移至96孔板，酶标仪读出560 nm处吸光度，根据吸光度计算各样品组SOD含量。

1.7 蛋白免疫印迹法检测牵正散合大补阴丸水煎剂对泛素/蛋白酶体途径中相关因子表达的影响

以2×105个/mL的密度将对数生长期的PC12细胞传至25 cm2细胞培养瓶中，培养24小时后分组及给药处理方式同1.4，继续培养48小时。用RIPA裂解收集贴壁细胞的蛋白，取少量稀释后测定蛋白浓度，并将其余蛋白进行变性。配制12%分离胶和浓缩胶，制胶后将各组样品加入上样孔中进行电泳，待各蛋白组分分离明显时用PVDF膜覆盖于SDS-PAGE胶上进行电转，随后将PVDF膜移至孵育盒中，用5%的脱脂奶粉室温条件下封闭2小时，加入一抗4℃孵育过夜，第二天加入二抗室温孵育1小时，TBST洗膜三次后，避光滴加发光液，曝光机中曝光扫描。使用Image J软件分析所得目的蛋白条带。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型凋亡的影响

与空白对照组相比，模型组及模型加药组坏死细胞百分比、凋亡细胞百分比不同程度升高，正常细胞百分比不同程度降低。与模型组相比，P+Q0组、P+Q25组及P+Q25+D0组坏死细胞、凋亡细胞百分比下降，正常细胞百分比增加。如表1及图1所示。

表1 牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型凋亡的影响

图1 牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型凋亡的影响

2.2 牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型上清液SOD活力检测

与空白对照组相比，模型组SOD活力值降低(P<0.05)；与模型组相比，除P+Q0组外，6个模型加药组SOD活力值均提高(P<0.05)。如表2所示。

表2 牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型上清液中SOD活力的影响

2.3 牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型TBP1-19蛋白表达水平的影响

与空白对照组相比，模型组TBP1-19蛋白表达水平降低；加药组的TBP1-19蛋白表达量较模型组高，其中P+Q0组、P+Q25+D0组和P+D25+Q25组的TBP1-19蛋白表达水平明显高于模型组。由此可见，PSI诱导PC12细胞后可下调TBP1-19蛋白水平的表达；牵正散和大补阴丸水煎剂两方合用对PSI诱导后PC12细胞中TBP1-19蛋白表达的下降有明显改善作用。 如图2、图3所示。

图2 牵正散及牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型TBP1-19蛋白表达的影响

图3 大补阴丸及牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型TBP1-19蛋白表达的影响

2.4 牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型PA28α蛋白表达水平的影响

蛋白免疫印迹法检测PA28α蛋白表达水平结果如图4、图5所示，模型组与空白对照组相比PA28α蛋白表达水平降低；各模型加药组与模型组相比，P+Q0组、P+Q25+D0组的PA28α蛋白表达水平升高。由此可知，PSI诱导PC12细胞后，可下调PA28α蛋白的表达；牵正散和大补阴丸及其合方水煎剂可明显提高PSI诱导后PC12细胞模型中PA28α蛋白的表达。

图4 牵正散及牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型PA28α蛋白表达的影响

图5 大补阴丸及牵正散合大补阴丸水煎剂对PSI诱导的PC12细胞模型PA28α蛋白表达的影响

3 讨论

中医学认为帕金森病属于“颤证”范畴，该病多以肝肾阴虚、气血不足为本，以风、痰、瘀、火为标[4]。帕金森病的中医临床治疗以熄风止颤为主，以补益肝肾、益气养血、清热祛痰及活血化瘀为辅[5]。《黄帝内经素问》 指出“诸风掉眩，皆属于肝”，而明代王肯堂在《证治准绳》中提出该病病机为“老年阴血不足，少水不能治盛火”，说明该病与肝风及阴虚火旺关系密切。牵正散与大补阴丸是经典的中医方剂，前者熄风止颤，后者补益肝肾，与本病治法相符。现代药理学研究指出，牵正散具有抗肿瘤、抗炎、镇静、抗惊厥作用[6-8]。大补阴丸组成药物的活性成分对神经系统在内的多个系统具有广泛药理作用[9-10]，其中龟板也具有保护神经的作用[11]。

目前应用PSI诱导PC12细胞是构建帕金森病体外细胞模型的常用方法，PSI作用24小时后，PC12细胞内可形成典型帕金森病特征[12]。而细胞凋亡在帕金森神经元损伤与丢失过程中起了重要作用[13]，荧光染色后，流式细胞仪检测可将凋亡、坏死以及正常细胞区分出来。检测发现各组不同浓度的药物作用于PC12细胞模型48小时后，模型组与空白对照组相比显示出PSI处理后PC12细胞坏死、凋亡比例升高，而加药组与模型组相比则均有不同程度降低细胞坏死和凋亡的作用，其中P+Q25+D0组及P+Q0组、P+Q25组效果较好。此外，抑制氧化应激反应是中医药治疗帕金森病相关作用机制之一[13]。SOD是生物体内氧化应激过程中一种重要的抗氧化酶，其活力升高能够消除或减轻氧自由基造成的伤害，保护机体。结果显示，模型组PC12细胞经PSI诱导后SOD较空白对照组活性下降，不同浓度的牵正散合大补阴丸水煎剂干预后，与模型组相比可使SOD值升高，达到缓解PSI造成的损伤、发挥保护细胞的作用。

帕金森病以中脑黑质中多巴胺神经元损伤、路易小体形成为病理特征，泛素是路易小体的成分之一，因此，泛素/蛋白酶体途径可能是帕金森病发病的相关通路。泛素/蛋白酶体途径与蛋白质代谢和功能紧密相关，是生物体内细胞蛋白降解系统的重要途径，TBP1-19、PA28α是该通路中的重要靶点，参与调节蛋白质降解。泛素/蛋白酶体途径中的FBXO7和Parkin两种蛋白与帕金森病发病有关，且有研究表明帕金森病患者发生黑质20S蛋白酶体的α2亚基以及激活亚基TBP1-19、PA28蛋白丢失[14-15]。经研究发现牵正散合大补阴丸水煎剂对泛素/蛋白酶体途径中的相关因子TBP1-19、PA28α蛋白的表达均有影响，且不同浓度的牵正散合大补阴丸水煎剂均可以改善PSI诱导的PC12细胞模型中的TBP1-19及PA28ɑ蛋白表达水平。

综上所述，不同浓度的牵正散合大补阴丸水煎剂可在不同程度上改善PSI诱导的PC12细胞模型坏死及凋亡情况，改善PSI诱导细胞模型中的SOD降低，提高TBP1-19、PA28α蛋白表达水平。体外实验验证了牵正散合大补阴丸水煎剂对帕金森病具有一定的保护作用，与柴原等人进行的小鼠体内实验结果一致[2]，这为临床治疗帕金森病提供了新思路。