基于qPCR技术分析黄连对溃疡性结肠炎小鼠肠道内嗜黏蛋白阿克曼氏菌的影响

杨光勇，涂小华，游丰锋，何亚敏，喻良锦，田维毅，何光志*

(1.贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二临床医学院，贵州 贵阳 550025;3.贵州中医药大学第一临床医学院，贵州 贵阳 550025)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是肠道免疫稳态被打破而导致的肠道炎症，病变主要限于结肠的黏膜，主要临床表现为腹泻、腹痛、黏液便及脓血便，会引起中毒性肠扩张、肠狭窄、肠穿孔、结肠癌等，这些症状严重影响患者正常生活和工作[1]。UC的病因与机制尚未明确，但肠道免疫紊乱是其发生发展的重要原因之一。肠道微生态系统是机体庞大、重要的微生态系统。肠道菌群按照对宿主的作用分为共生生理性细菌、共栖条件致病菌和病原菌，其中共生生理性细菌为专性厌氧菌,是肠道优势菌群，占肠道菌群总量的99%，而98%的厌氧菌分布于盲肠与结肠[2]，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila)就是其中之一。A.muciniphila的代谢产物丙酸对机体有明确的免疫调节作用，在糖尿病、肥胖症、溃疡性结肠炎、结肠癌等多种疾病中具有重要的作用[3]。

黄连清热燥湿，泻火解毒，是诸多治疗溃疡性结肠炎的方剂中的主要成分，黄连中的盐酸小檗碱和黄连碱[4]等多种成分通过改善受损的肠黏膜屏障和调节肠道微生态，在治疗溃疡性结肠炎中起到较强的抗炎和免疫调节作用。前期研究发现黄连解毒汤对大鼠肠道内的A.muciniphila菌有促进作用[5]，为进一步研究黄连对其在UC小鼠中的影响，本研究通过与传统药物美沙拉嗪进行对比实验，用实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR, qPCR)对各组结果进行绝对定量分析，从肠道特定共生菌群A.muciniphila细菌的角度出发，探究黄连对该菌的作用在UC疾病中的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6周龄KM小鼠40只，雌雄各半，体质量(20±2)g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物使用许可证号：SCXK(湘)2019-0014。小鼠以小组单笼喂养，自由进食和饮水，环境：湿度60%、温度25 ℃、12 h/12 h的光照/黑暗周期。所有实验操作符合3R原则(减少、替代、优化)给予人道关怀。

1.2 实验试剂与药品

右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS，Sigma-Aldrich 公司，批号：H02J9B62777)；中草药黄连(北京同仁堂)；美沙拉嗪(莎尔福公司，批号：17G27518L)；粪便基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司，批号：S8114)；2×RealStar Green Fast Mixture(GeneStar 公司,批号：9AG01)；96-Well PCR Plate HC96101-01，(GeneStar 公司,批号：9BC01)；PCR Sealing Film HC96551-01，(GeneStar公司,批号：9BB01)。

1.3 主要仪器

CFX96TM实时PCR检测仪(BIO-RAD,美国)，核酸浓度检测仪(Thermo Fisher Scientific,美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 药物制备及给药方法

按人与小鼠体表面积折算计算给药剂量，配制成6.5 mg/mL的美沙拉嗪药液，按0.1 mL/10 g体积对小鼠灌胃给药，每天3次；从北京同仁堂购入黄连，制备水煎药。参考李国辉[6-7]等实验研究，为避免对小鼠产生抑菌效果和脑神经损伤，最终将给药剂量定为0.3 g/kg。取3 g黄连，用100 mL去离子水泡20 min，水煎30 min左右，再补足去离子水至100 mL即为3×10-2g/mL浓度。给药剂量0.3 g/kg即是3×10-3g/10 g，则一只体质量20 g的小鼠给药量为6×10-3g，即按3×10-2g/mL剂量取0.2 mL，每天1次灌胃给药。

1.4.2 实验分组及UC模型制备

小鼠按随机数字表法分为空白对照组，模型组，美沙拉嗪组(65 mg/kg)，黄连组(0.3g/kg)，每组10只。空白对照组给予蒸馏水，参考李望[8]、吴昊[9]和胡仁伟[10]等探讨总结的诱发小鼠较理想的UC模型的方法，用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导制备UC小鼠模型，各组采用3% DSS溶液连续灌胃7 d，诱导UC模型，第8天开始全部换成蒸馏水。造模成功后第1天开始灌胃给药，除空白对照组与模型组给予蒸馏水外，其余各组按上述剂量给予相应的药物，连续给药10 d。

1.4.3 引物设计与合成

根据秦倩倩[11]等的研究，合成A.muciniphila细菌基因特异性引物，上游引物：5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3′，下游引物：5′-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3′，基因全长：329 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.4 各组样品基因组模板制备

DNA实验第18天，收集小鼠新鲜粪便，用粪便基因组DNA试剂盒说明书严格进行操作，提取基因组DNA，用核酸浓度检测仪测定提取的DNA模板的纯度及浓度，确保DNA纯度A260/A280比值在1.8左右，浓度在200 ng/μL左右，均置于-20 ℃保存备用。

1.4.5 qPCR标准品目的DNA的制备

用空白对照组DNA进行PCR扩增，并将扩增产物提取后送上海生物工程有限公司合成进行克隆测序，测序结果显示与Gene-Bank公布序列(NR_042817.1)一致，抽提克隆菌质粒保证其质量在4 μg以上。选用在20 μL体系终浓度0.5 ng/μL的标准品目的DNA的拷贝数为：copies/μL=(9.12×1011)×(0.5 ng/μL)/(1 865+329 bp)≈2.0×108copies/μL。

1.4.6 qPCR反应体系和扩增条件

参考秦倩倩[11]等研究的方法用标准品目的基因质粒进行实验和调整。取上述20 μL体系终浓度0.5 ng/μL的克隆基因质粒再稀释10倍作为模板。反应采用20 μL体系：5 ng/μL模板2 μL，10 μmoL/L上下游引物各0.3 μL，2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL，去离子水补充体系至20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，39个循环；荧光信号采集设在72 ℃。反应结束后，设65～95 ℃的溶解曲线，温度以0.5 ℃/5 s递增。根据实验结果荧光信号是否呈指数增长、定量循环数(quantification cycle,Cq)值及溶解曲线来综合判断结果。

1.4.7 标准曲线制备

将上述已制备的标准品进行10倍梯度稀释(2.0×108copies/μL)～(2.0×103copies/μL)每个梯度各设3个平行进行重复试验，设置无模板对照(no template control,NTC)，建立标准曲线并检验方法的灵敏度。

1.4.8 特异性实验

提取本实验室的基因组DNA，包括大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、金黄色葡萄糖球菌、肠球菌、拟杆菌进行特异性检测，A.muciniphila菌为阳性对照。

1.4.9 统计分析

实验结果采用绝对定量，绘制标准曲线，检测方法灵敏度和特异性，统计方法用CFX96TM实时PCR检测仪进行ΔCt分析，计算每组基因拷贝数均数±标准差值，以空白对照组(control group)作为对照参考，每组8个样本，各设置3个平行。

2 结果

2.1 标准曲线的制备及方法灵敏度

(2.0×108copies/μL)～(2.0×103copies/μL)6个梯度，每个梯度3个平行进行重复试验的A.muciniphila基因qPCR扩增结果呈指数增长期的曲线平行扩增(图1)，熔解曲线均出现特异性单峰(图2)显示峰值在87.5 ℃，NTC结果显示个别有杂峰，Cq值在31左右，与2.0×103copies/μL的Cq值27左右相差值约3.32，基本符合BIO-RAD公司提供的实时荧光定量PCR国际化标准,即MIQE指南的10倍梯度稀释，MIQE指南即发表实时荧光定量PCR实验所须提供的最低信息量(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)，故推断方法的灵敏度为2.0×102copies/μL。R2=0.998，斜率为-3.512符合MIQE中要求的3.3～3.8之间标准，截距为39.033，扩增效率92.6%符合MIQE 90%～105%的标准。因标准曲线以10倍浓度稀释，根据以上信息，以DNA拷贝数为横坐标，Cq值为纵坐标生成标准曲线(图3)，线性关系为Cq=-3.512×lgX+39.093，即X=10^[(Cq-39.033)/-3.512]，其中X为qPCR结果对应的拷贝数copies/μL，线性良好，可用于定量分析。

注:①～⑥：2.0×108，2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103copies/μL；⑦：NTC。图1 A.muciniphila菌qPCR灵敏度实验扩增曲线

图2 A.muciniphila菌qPCR灵敏度实验熔解曲线

图3 A.muciniphila菌qPCR灵敏度与重复性实验标准曲线

2.2 方法特异性

除A.muciniphila菌为阳性对照样本具有特异性扩增外，其余阴性样本均出现非特异性扩增现象(图4)，说明该方法特异性良好，可结合熔解曲线(图5)综合判定结果。

图4 A.muciniphila菌qPCR特异性实验扩增曲线

图5 A.muciniphila菌qPCR特异性实验熔解曲线

2.3 qPCR对各组A.muciniphila菌的定量

各组粪便中A.muciniphila菌的绝对定量检测结果显示呈指数增长期的曲线平行扩增(图6)，熔解曲线均出现特异性单峰(图7)显示峰值在87.5 ℃，NTC结果无扩增；表1ΔCt分析情况显示，以空白对照组为组间参照时黄连组的相对值明显升高，美沙拉嗪组稍有降低，模型组有一定升高；如表1所示，各组A.muciniphila细菌基因拷贝数分别为空白组(1 233.11±96.03)μL，模型组(2 019.62±194.02)μL，黄连组(268 501.74±54 703.05)μL，美莎拉嗪组(871.86±73.41)μL。各组与模型组比较，空白对照组基因拷贝数约为其2倍，黄连组约为133倍，美沙拉嗪组约为0.43倍。各组样本Cq值箱线图显示空白对照组内差异最小，模型组和美沙拉嗪组各自组内差异不大 ，黄连组组内差异较大，但不超过0.5，符合MIQE指南，可以进行相关分析。

图6 A.muciniphila菌qPCR各组实验扩增曲线

图7 A.muciniphila菌qPCR各组实验熔解曲线

图8 各组样本Cq值箱线图

表1 各组样本中A.muciniphila菌qPCR检测结果ΔCt分析情况

3 讨论

A.muciniphila的生存与增殖仅用肠道黏蛋白作为唯一碳源和氮源，过多种机制维持肠道稳态。黏蛋白增多症与肥胖、糖尿病、心脏代谢疾病和轻度炎症呈负相关[12]，其分解黏蛋白并刺激杯状细胞合成黏蛋白达到动态平衡的特性使其成为维持肠道黏膜屏障的关键微生物[13]。A.muciniphila菌的代谢产物短链脂肪酸主要为丙酸，存在于靠近肠上皮细胞的黏液层，丙酸通过 G 蛋白偶联受体43作用于肠道组织对机体有明确的免疫调节作用[14]。A.muciniphila菌鞭毛中的膜型毛样蛋白Amuc_1100是Toll样受体2的激活剂，可调节宿主免疫应答和肠道屏障功能[14]，维持体内代谢平衡，在糖尿病、肥胖症[15]、溃疡性结肠炎、结肠癌等多种疾病[16]中具有重要的作用，膳食对它的调控尤其显著。高丰富度的A.muciniphila似乎有利于粪便菌群移植治疗难治性慢性活动性溃疡性结肠炎[16]。

研究显示，二甲双胍及一些寡聚果糖[17]、石榴鞣单宁[18]和膳食纤维[3]等可以增加肠道内A.muciniphila细菌，而相关中药对其却少有报道。黄连清热燥湿，泻火解毒，是诸多治疗溃疡性结肠炎的方剂中的主要成分，其中盐酸小檗碱、黄连碱等多种成分在治疗溃疡性结肠炎中也具有重要作用[4]。

本研究用qPCR技术分析黄连对溃疡性结肠炎小鼠模型结肠段A.muciniphila细菌的定殖数量变化，探讨黄连对溃疡性结肠炎肠黏膜屏障和机体炎症反应的影响，可为黄连调控A.muciniphila细菌的定殖以改善治疗溃疡性结肠炎提供科学依据。研究结果表明，A.muciniphila细菌在模型组小鼠肠道中有一定增殖情况，这与黏蛋白在结肠炎肠道中增加有关。美沙拉嗪可轻微抑制A.muciniphila菌，可能跟其主要成分5-氨基水杨酸可用于治疗结核病的抗菌药的抗菌效果有关，也可能是因为其作用于炎症黏膜，抑制引起炎症的前列腺素合成和炎症介质白三烯的形成，对肠壁炎症有显著的消炎作用的炎症治疗效果，从而导致引起炎症的肠道黏蛋白分泌减少，进一步导致仅将肠道黏蛋白作为唯一碳源和氮源的A.muciniphila菌群数量减少。黄连对DSS诱导的UC模型小鼠肠道中的A.muciniphila细菌有明显促进增殖的作用，因黄连本身与美沙拉嗪相似，都具有抑菌作用和抗炎效果，但可能抑制的菌群种类和数量不同，其具体促进A.muciniphila细菌增殖机制还需进一步研究。