RA患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平与其病情程度及疾病活动程度的相关性

史向辉 严婷婷 沈 洁 叶 俏

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床常见的自身免疫性疾病，多发于中老年人群，主要临床表现为慢性关节滑膜炎症[1]。目前临床上以药物治疗和手术治疗为主，可一定程度缓解炎症反应和改善关节功能，但RA 病情反复，治愈难度较大，早诊断、早治疗可有效提高治疗效果、缓解疼痛、提高生活质量[2-3]。T、B细胞等免疫细胞的水平、功能异常在RA 的病理生理机制中发挥重要作用，调节性B细胞（regulatory B cells，Breg）通过产生白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子而负性调节免疫功能，同时还能抑制Th细胞（Th1、Th17）的分化、增殖，从而进一步降低树突状细胞（dendritic cell，DC）释放炎性因子[4-5]。DC 是机体功能最强的抗原提呈细胞，参与免疫应答的起始环节，可直接激活静息型T 淋巴细胞产生免疫应答，其中髓系树突状细胞（mDC）参与滑膜炎症的发生[6]。RA患者外周血中Breg、mDC和Th细胞作为维持机体免疫功能的重要免疫细胞，均参与RA 的发生过程，但关于其水平变化与疾病程度的相互关系文献报道并不多见，因此本文将通过实例进一步探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取浙江省嘉兴市第二医院风湿免疫科于2017 年8 月—2019 年12 月收治的96例RA患者为研究组，根据28 处关节疾病活动度积分（disease activity score in 28 joints，DAS28）[7]评分：低度活动24例、中度活动40例、高度活动32例；病情程度[8]：Ⅰ级20例、Ⅱ级24例、Ⅲ级30例、Ⅳ级22例；同时选取同期我院体检健康者60 名为对照组。本研究经本院医学伦理委员会审核通过，批件号：No.jxey-2018044。

1.2 纳入及排除标准 RA患者纳入标准：（1）符合《2010 中国类风湿关节炎诊疗及治疗指南》[9]的RA分类标准；（2）患者病历资料完整，依从性好，具备读写能力，均签署知情同意书。排除标准：（1）伴随其他风湿性疾病（干燥综合症、系统性红斑狼疮、膝骨关节炎等），甲状旁腺功能亢进或减退症等；（2）严重的心脑血管疾病、皮肤疾病、胃肠疾病等，其他慢性疾病（如糖尿病）；（3）入组前3 个月内服用糖皮质激素、雌激素或者补充钙剂；（4）骨质疏松、感染、骨折、肿瘤等引起的关节疼痛或者损伤；（5）哺乳期、妊娠期妇女。

1.3 方法 外周血Breg、mDC和Th细胞水平：采用流式细胞仪（厂家：赛默飞世尔，型号：Attune NxT）检测外周血单个核细胞中CD11c+CD123-mDC、CD19+CD24hiCD38hi Breg 以及Th1细胞和Th17细胞水平。所有患者入组后，空腹抽取外周静脉血约5mL，肝素抗凝。淋巴细胞分离液Ficoll 密度梯度离心法进行分离，吸取分层液的液面细胞提取外周血单核细胞（PBMC），磷酸盐缓冲液重悬待测。检测Breg 时分别加入anti CD19 APC 抗体（Invitrogen公司，批号SZB13444），检测Th1细胞和Th17细胞时加入PE-Cy5-CD4 mAb（Invitrogen 公司，批号555348），室温避光孵育15min 后加入固定膜剂/破膜剂混合液，4℃避光孵育60min。最后分别加入Anti-IL-10-PE、PE-cy7 标记的抗人CD123 抗体、FITCIFNγ-mAb 抗体、FITC-IL-17 mAb（Becton Dickinson公司，批号MAB6607），于4℃温孵育30min，用PBS洗涤3 次后并悬浮，采用流式细胞术检测。检测mDC时则加入FITC-CD4、APC-CD3、PE-CD24、APCCD38 抗体（Becton Dickinson 公司，批号3401111），室温避光孵育15min 后加入固定膜剂/破膜剂混合液，室温避光孵育15min，300r/min 离心约5min，弃上清液，加入染色缓冲液后重悬细胞，采用流式细胞术检测即可。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0 软件分析所有数据，其中计量资料符合正态分布，以均数±标准差（）表示，两组间比较采用LSD-t 检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，相关性分析采用Pearson分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组和对照组一般资料比较 研究组和对照组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。见表1。

表1 研究组和对照组一般资料比较

2.2 研究组和对照组外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较 研究组Breg 水平显著低于对照组，而mDC、Th1、Th17 显著高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 研究组和对照组外周血外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较（%，）

表2 研究组和对照组外周血外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较（%，）

注：研究组为类风湿关节炎患者；对照组为健康体检者；Breg 为调节性B细胞；mDC 为树突状细胞；Th1 为辅助性T细胞1；Th17 为辅助性T细胞17

2.3 不同关节活动度患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较 三组患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平差异显著，其中低度活动组患者Breg 水平显著高于中度、高度活动组患者，而mDC、Th1、Th17水平显著低于中度、高度活动组患者（P＜0.05），中度活动组Breg 水平显著高于高度活动组患者，而mDC、Th1、Th17 水平显著低于高度活动组（P＜0.05），见表3。

表3 不同关节活动度类风湿关节炎患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较（%，）

表3 不同关节活动度类风湿关节炎患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较（%，）

注：Breg 为调节性B细胞；mDC 为树突状细胞；Th1 为辅助性T细胞1；Th17 为辅助性T细胞17；与低度活动组比较，aP＜0.05；与中度活动组比较，bP＜0.05

2.4 不同严重程度患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较 四组患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平差异显著，其中Ⅰ级患者Breg 水平显著高于Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级，而mDC、Th1、Th17 水平显著低于Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级（P＜0.05）。Ⅱ级患者Breg 水平显著高于Ⅲ级、Ⅳ级，而mDC、Th1、Th17 水平显著低于Ⅲ级、Ⅳ级（P＜0.05）。Ⅲ级患者Breg 水平显著高于Ⅳ级，而mDC、Th1、Th17 水平显著低于Ⅳ级（P＜0.05），见表4。

表4 不同严重程度类风湿关节炎患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较（%，）

表4 不同严重程度类风湿关节炎患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平比较（%，）

注：Breg 为调节性B细胞；mDC 为树突状细胞；Th1 为辅助性T细胞1；Th17 为辅助性T细胞17；与Ⅰ级比较，aP＜0.05；与Ⅱ级比较，bP＜0.05；与Ⅲ级比较，cP＜0.05

2.5 外周血Breg、mDC和Th细胞水平与DAS28 评分的相关性 Pearson 相关性分析结果显示，Breg 与DAS28 评分呈负相关（r=-0.721，P＜0.05），与mDC、Th1、Th17 与DAS28 评分呈现正相关性（r=0.570、0.724、0.797，P＜0.05）。见图1-4。

图1 类风湿关节炎患者外周血Breg 水平与DAS28 评分相关性（96例）

3 讨论

图2 类风湿关节炎患者外周血mDC 水平与DAS28 评分相关性（96例）

图3 类风湿关节炎患者外周血Th1 水平与DAS28 评分相关性（96例）

RA患者体内T、B细胞异常活化，导致大量的炎性因子（TNF-α、IL-1 等）、自身抗体（RF、CCP 抗体）产生，加重炎症反应，引起血脂代谢紊乱、骨质疏松、关节破坏，最终导致关节畸形、功能丧失[10-11]。mDC 具有极强的激活T细胞反应的能力，通过抗原提呈作用促进T细胞活化以及分化为各种功能性亚群，Th1、Th17 是重要的炎症细胞[12]。Th17 可大量分泌TNF-α、IL-17、Th1 可大量分泌IFN-γ、TNF-α 等，从而激活机体发生病理免疫应答，如关节局部炎症细胞的大量浸润及炎症因子的大量释放可导致炎症损伤[13]。Breg 则可通过分泌转化生长因子而抑制巨噬细胞、B细胞、T细胞参与炎症反应，从而抑制关节炎症[14]，因此免疫细胞水平的失衡对疾病的发生、发展至关重要。本研究结果显示，研究组Breg 水平显著低于对照组，而mDC、Th1、Th17 显著高于对照组（P＜0.05），表明RA患者外周血mDC、Th1、Th17细胞水平明显升高，而Breg 水平明显降低，免疫状态失衡，正调节相关的炎症细胞大量产生，导致炎因子大量分泌，进而引起骨侵蚀、关节破坏、滑膜损伤，导致RA 的发生。吴桂英和李鸿斌[14]研究发现，RA患者外周血Breg细胞以及相关因子（TGF-β、IL-10）表达水平明显低于健康人，通过有效治疗后均存在增加趋势，表明Breg细胞比例降低以及负性调节功能缺失是导致RA 的重要因素。IL-17 是Th17细胞分泌的主要细胞因子，参与白细胞的迁移和活化，以及在骨质破坏反应中影响破骨细胞的活化以及骨质的吸收，姚血明等[15]研究发现，RA患者外周血Th17细胞水平明显高于健康者，其水平与肿胀关节数、压痛关节数以及DAS28 评分存在正相关性，与本次研究而结果相近。罗莉等[12]认为，成熟的mDC 在外周血中的水平低于关节液，可能为成熟的mDC 迁移至关节液后并大量聚集，分泌大量的IL-12 诱导CD4+T细胞大量增殖等，最终导致关节炎症反应，引起关节疼痛，增加疾病活动度。

图4 类风湿关节炎患者外周血Th17 水平与DAS28 评分相关性（96例）

本研究发现，随着疾病严重程度的增加，患者外周血mDC、Th1、Th17细胞水平均明显增加，而Breg水平明显降低，且通过Pearson 相关性分析结果显示Breg 与DAS28 评分呈负相关（r=-0.721，P＜0.001），mDC、Th1、Th17 与DAS28 评分呈现正相关性（r=-0.570、0.724、0.797，P＜0.001），表明Breg、mDC、Th1、Th17 与疾病严重程度密切关联，可通过血清水平预测、评估疾病情况，从而指导医师临床诊治。Th细胞与DC细胞间的相互调节是一个复杂的过程，RA患者体内存在着以Th1 为主体的多种免疫失衡状态，其中mDC 是刺激、调节T细胞的最主要的DC细胞，如Ainola 等[16]研究发现，浆细胞样树突细胞（pDC）可诱导免疫耐受，通过抑制T细胞的应答而降低IL-17 水平，表明机体免疫细胞相互调控，共同维持免疫状态。韩捷等[17]认为，mDC 激活后产生的IFN-γ、TNF-α 等可促进Th0 转化为Th1，Th1 表现出免疫杀伤效应，RA患者外周血中Th1 水平明显高于健康者，且RA 病程中以Th1 免疫反应为主，随着疾病的进展，外周血、关节液中Th1细胞水平展显著升高，与本次研究结果相近。Breg细胞可降低CD4+T细胞的增殖，还能通过细胞间接触以及分泌TGFβ 以增加Foxp3＋Treg细胞的表达，动物实验已证实Foxp3＋Treg 可抑制RA患者的炎症反应[14]。Kim 等[18]研究发现，RA患者外周血中IL-10和Breg细胞水平明显低于健康者，且Breg细胞表达率与DAS28 评分存在负相关性，与本次研究结果相近，进一步表明Breg 在RA 的发生发展中发挥负性调节作用，从而改善炎症反应、自身抗体水平以及疾病活动度。

综上所述，RA患者外周血Breg、mDC和Th细胞水平均异常表达，其中Breg细胞水平与活动度严重程度负相关，mDC和Th细胞水平与活动度严重程度正相关。