基于调控ABCA1 表达探讨升麻苷抗动脉粥样硬化的作用机制

王仙伟 雷 虹 何欣威 朱 峰 柯绍发

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是脑梗、心梗、高血压等心脑血管疾病的主要病理基础，涉及炎症细胞浸润，脂质代谢紊乱，氧化应激，内皮细胞损伤等一系列反应过程[1-2]。心脑血管疾病死亡率高居榜首[3-4]。研究表明，炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）参与AS 炎症反应，同时脂质失衡、细胞内胆固醇外流减少是AS 发生、发展过程中的重要环节之一[5-6]。前期有效防治AS 病理进展可降低心脑血管疾病的发病率与死亡率。升麻苷（cimicifugoside）为防风的有效成分，能够改善内皮细胞炎性因子IL-6、TNF-α 的释放，抑制单核与内皮细胞黏附性增高，从而达到抑制AS 炎性反应的作用，腺嘌呤核苷三磷酸结合盒转运体A1（ATPbinding cassette A1，ABCA1）是胆固醇逆向转运蛋白之一，其可介导细胞内胆固醇外流进而达到平衡脂质的作用[7-9]，本文探讨升麻苷防治AS 的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞 THP-1 人单核细胞（批号SCSP-567，中科院上海细胞生物所）。

1.2 药品 升麻苷（批号D83729，上海源叶生物科技有限公司）。

1.3 试剂与仪器 RPMI1640 培养基、胎牛血清均购自Gibco 公司（批号27387663、12337648）；CCK8试剂盒（批号AJ30298，DOJINDO 公司）；佛波酯（PMA）（批号52391EA03，上海翊圣生物科技有限公司）；ECL 极超敏显色液（批号P0018FM，碧云天公司）；IL-6 与TNF-α ELISA 试剂盒、油红O 染色试剂盒（批号H007-2、H053-56、D027-1-1，南京建成）；β-actin 抗体（批号CS-2311，武汉博士德生物科技有限公司）；；ABCA1、IL-6、TNF-α 抗体（批号ab66217、ab233706、ab255275，Abcam 公司）。Cytation1多功能酶标仪（美国Biotek），纯水仪（美国MILLIPORE 公司，Synthesis A10），倒置显微镜（日本尼康，Ti2），双色红外激光成像系统（美国Odyssey CLX）。

2 实验方法

2.1 泡沫细胞诱导及鉴定 THP-1细胞培养于RPMI-1640（含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素、100μg/mL 链霉素）培养液中，静置培养于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，每36h 换液1 次，每48～72h传代1 次，于传代3 次后第1 天取对数生长期细胞铺板实验，每次细胞实验中使用150nmol PMA 孵育细胞24h，正常THP-1细胞在400 倍光镜下呈悬浮状态，为圆形或卵圆形，而PMA 刺激后显微镜下细胞形态不规则且大部分细胞伸出伪足，证实THP-1细胞已分化成为巨噬细胞[10]，更换孔板培养液后加入终浓度为50mg/L 的低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导THP-1 源性巨噬细胞泡沫化48h 后加入升麻苷进行干预研究。

2.2 油红O 染色 取对数生长期细胞培养于6 孔板，经分化处理后使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗，3×5min。50%异丙醇固定1min，油红O 红色储备液染色10min，复染液染色3～5min，水洗30～60s，封片后镜检。

2.3 CCK8 法测定细胞存活率 96 孔板四周外圈孔板铺PBS，于中间孔板部分铺浓度为2×104个/mL 的泡沫细胞200μL，每组6 个复孔，培养48h，使得细胞处于对数生长期。各组加入体积分数为10%的CCK8试剂，作用3h 后，使用Cytation1 酶标仪测量450nm处的吸光度，统计分析后计算细胞存活率。

2.4 TNF-α 及IL-6 测定 将ox-LDL 诱导的泡沫细胞传代后，接种对数生长期细胞于6 孔板中，密度为3×104个/mL，培养于37℃、5%CO2的培养箱中。培养48h 后收集各组细胞上清液，根据试剂盒说明书进行TNF-α 及IL-6 测定。

2.5 Western blot 检测相关蛋白表达 收集各组细胞加入细胞裂解液（含苯甲基磺酰氟1mmol/L），置于冰上裂解30min 后12000r/min 4℃离心15min。离心获得蛋白用BCA 法测定浓度，加入5×蛋白上样缓冲液于95℃变性15min。8%～12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，电泳后的蛋白样品转移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%的脱脂奶粉室温封闭1h，TBST 洗膜3 次后孵育相应一抗（1∶1000）4℃过夜，TBST 洗膜3次后室温孵育相应二抗（1∶5000）2h，使用ECL 试剂盒化学发光，Fluor chem R 成像系统扫描分析蛋白条带。

2.6 细胞内胆固醇流出率测定 采用闪烁计数法测定，细胞孵育结束后接种于24 孔板，调整适当的细胞密度，当细胞融合率到达90%时，使用0.2μCi/mL[3H]胆固醇孵育24h。弃去细胞培养液，PBS 液洗涤细胞3 次，再用含1% FBS 的RPMI-1640 培养液平衡24h。PBS 洗涤细胞后使用闪烁液裂解细胞，用闪烁计数法检测培养液和细胞中的[3H]胆固醇。胆固醇流出率=（培养液counts/min 值）/（总counts/min 值）×100%，其中总counts/min 值=培养液counts/min 值+细胞counts/min 值，以百分比（%）显示统计。

2.7 统计学方法 应用GraphPad Prism 8.0和SPSS 20.0 软件对实验数据统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，进行单因素方差分析（多组）或Student’s t 检验（两组），P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 THP-1 源性巨噬泡沫细胞的诱导分化 以PMA 诱导THP-1 单核细胞，24h 后可见细胞呈梭形贴壁生长，多数细胞伸出伪足，说明细胞已分化为巨噬细胞（见图1A）。对分化的巨噬细胞使用ox-LDL孵育48h，使用10%油红O 染色，显微镜下观察可见细胞质内大量红色脂质颗粒，呈现出泡沫细胞的形态特点，见图1B。

图1 THP-1 源性巨噬泡沫细胞的诱导分化（油红O 染色×40）注：A 为PMA 诱导分化的THP-1 单核细胞；B 为油红O 染色oxLDL 孵育后的巨噬细胞

3.2 不同浓度升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞存活率的影响 不同浓度升麻苷处理THP-1 源性巨噬泡沫细胞48h，CCK8 法检测细胞存活率，结果显示，与空白对照相比，升麻苷浓度≤64μg/mL 时差异无统计学意义，且细胞活力维持在90%以上，因此该范围浓度内升麻苷对细胞作用无明显毒性；而当浓度到128、256μg/mL 时，细胞活力降低（P＜0.05 或P＜0.01），表明高浓度升麻苷处理细胞可能存在毒性，进而选择16、64μg/mL 作为后续药物干预浓度，见表1。

表1 各组细胞活力比较（%，）

表1 各组细胞活力比较（%，）

注：与对照组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

3.3 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞上清液TNF-α、IL-6 含量影响 THP-1 源性巨噬泡沫细胞组上清液中TNF-α 与IL-6 的含量明显增加，表明经诱导后的细胞具有明显的炎症反应（P＜0.01），而经16、64μg/mL 升麻苷干预，可降低培养液中TNF-α与IL-6 的含量，且呈现出浓度相关性，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），见表2。

表2 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞TNF-α、IL-6含量影响（pg/mL，）

表2 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞TNF-α、IL-6含量影响（pg/mL，）

注：ox-LDL 为氧化低密度脂蛋白；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-6为白介素-6；与对照组比较，aP＜0.01；与ox-LDL 模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.4 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞相关蛋白表达影响 Western blot 检测结果表明，与对照组相比，ox-LDL 模型组的IL-6、TNF-α 蛋白表达均明显增加，膜整合蛋白ABCA1 表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。经16、64μg/mL 升麻苷药物干预后，IL-6、TNF-α 蛋白表达量降低，ABCA1 蛋白表达量增强（P＜0.05 或P＜0.01），见表3、图2。

表3 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞IL-6、TNF-α和ABCA1 蛋白表达影响（）

表3 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞IL-6、TNF-α和ABCA1 蛋白表达影响（）

注：ox-LDL 为氧化低密度脂蛋白；IL-6 为白介素-6；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；ABCA1 为腺嘌呤核苷三磷酸结合盒转运体A1；与对照组比较，aP＜0.01；与ox-LDL 模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

图2 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞相关蛋白表达影响（n=4）

3.5 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞胆固醇流出影响 ox-LDL 模型组泡沫细胞处理后胆固醇流出率较对照组显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。经16、64μg/mL 升麻苷干预细胞后胆固醇流出率进一步增加，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），见表4。

表4 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞胆固醇流出的影响（%，）

表4 升麻苷对THP-1 源性巨噬泡沫细胞胆固醇流出的影响（%，）

注：ox-LDL 为氧化低密度脂蛋白；与对照组比较，aP＜0.01；与ox-LDL模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

4 讨论

心脑血管疾病严重危害人类生命健康，AS 是心脑血管疾病的主要病理基础，其与心脑血管疾病的发生、发展、复发有着密切的关系，以AS 为基础的缺血性事件发病率和死亡率仍在迅速增加[11-13]。IL-6是一种上游炎性细胞因子，在导致AS 的下游炎症反应中起重要作用[6]，此外，促炎细胞因子TNF-α 可以激活血液中的单核细胞，这是炎症状态的标记[5，9，14]。ATP 结合盒转运体是调节胆固醇外排的重要组成部分，被称为逆向胆固醇转运的把守蛋白，而ABCA1是该蛋白家族的重要成员，其具有多种复杂的功能，能介导细胞内磷脂和胆固醇流出，并且在HDL 代谢过程中起重要作用进而维持巨噬细胞内胆固醇的稳态[7，15-17]。巨噬细胞来源的泡沫细胞凋亡导致AS斑块坏死核心的形成，减少斑块区域细胞基质的排泄，可能导致斑块不稳定和大多数心血管并发症[13，17]。AS的发生、发展全程都伴随着泡沫细胞的形成，若能够抑制泡沫细胞的形成同时减少斑块内部的脂质沉积是目前抗AS 的主要治疗策略[18]。

中医认为，AS 属于脉络病变范畴，但根据其临床表现涉及中医“眩晕”“胸痹”“中风”等疾病。病因多属本虚标实，气虚、阴伤、血虚为发病之本，风、火、痰、瘀为发病之标，本病病位在脉络，脉络失养是AS重要的病理机制。《本草新编》言：“防风，味甘、辛，气温，升也，阳也，无毒。系太阳本经之药，又通行脾、胃二经。古人曾分上、中、下以疗病，其实，治风则一。”防风解表祛风，胜湿，止痉，研究表明，其具有显著的抗炎、解热、镇痛作用[19-21]。基于上述理论，本实验通过研究防风中的主要成分升麻苷，从中西医结合角度探讨升麻苷对AS 病变过程中泡沫细胞的药理作用。

AS 的病理变化包括脂质条纹、纤维斑块、粥样斑块、复合病变等，而泡沫细胞是AS 病变的早期细胞学特征。泡沫细胞由单核/巨噬细胞和从动脉中膜迁移到内膜的平滑肌细胞摄取大量脂质而成。本研究使用的THP-1 人源性单核细胞经过PMA 与ox-LDL 联合诱导后制备的THP-1 源性巨噬泡沫细胞是目前研究AS 最为常用的细胞实验方法[22]。结果显示，经过ox-LDL 处理后的THP-1 源性巨噬泡沫细胞TNF-α 与IL-6 显著降低，而加入本实验设定的低、高浓度的升麻苷后，均可降低上述炎症因子的分泌。因此升麻苷在一定程度可改善泡沫细胞的炎症反应。本研究还显示，经过ox-LDL 处理后的泡沫细胞ABCA1 的表达明显降低，而加入低、高浓度的升麻苷后，可升高ABCA1 的表达。本研究结果还显示，ox-LDL 超载条件下，升麻苷能够促进胞内胆固醇外排，抑制THP-1 巨噬细胞模型胆固醇的积累。这提示，升麻苷可能是通过上调ABCA1 表达，促进泡沫细胞胆固醇流出，发挥抑制泡沫细胞脂质蓄积的作用。目前认为PPARγ-LXRα 通路是调控ABCA1 蛋白表达的核心通路[23-25]，下一步我们将会探讨升麻苷是否通过该通路影响ABCA1 蛋白的表达，从而达到抑制胞内胆固醇积累的作用，并在动物模型中观察其对动脉硬化斑块的干预作用。总之，细胞研究结果初步表明，升麻苷可能具有抗AS 进展的作用，值得进一步深入研究。