高氮负荷沼液灌溉对紫色土氮素积累、淋溶和微生物多样性的影响

王康婷，伍福琳，周忠波,2，陈玉成,2①

(1.西南大学资源环境学院，重庆 400716；2.农村清洁工程重庆市工程研究中心/ 重庆市生态环境农用地土壤污染风险管控重点实验室，重庆 400716)

随着环境问题的日益凸显，人们对环境质量的要求越来越高，不合理的沼液农用产生的环境负面影响逐渐引起人们的关注。在实际生产中，沼液灌溉量为120～300 t·hm-2，折算成施氮量为600～1 500 kg·hm-2(以氮质量含量0.5%进行折算)，是欧洲农业政策部规定的粪肥年施氮量限量标准(170 kg·hm-2)的3.5～8.8倍，也远远超出我国肥料领域专家朱兆良[1]认为的农田氮肥安全施用量(150～180 kg·hm-2)。高负荷沼液灌溉存在一定环境风险。沼液含有丰富的氮、磷等营养元素，过量施用会引起土壤富营养化，出现烧苗、抑制作物生长等现象，也会明显增加沼液中氮素的淋失风险和径流污染风险[2]。同时，施用过量沼液将显著降低土壤细菌群落多样性，土壤中优势菌群将通过改变种群结构的方式来适应由于过量沼液灌溉所引起的土壤养分含量等变化。随着灌溉时间的增加，施用过量沼液对土壤微生物种群结构的影响也会越来越大[3]。因此，高负荷(短期高频)沼液灌溉对土壤生态环境的影响值得探讨。黑麦草是长江流域主栽牧草，生长周期短，营养丰富，适应性强，对养殖废水有良好的消纳作用[4]。基于此，笔者采用土柱试验和高通量测序方法，研究高负荷猪场沼液灌溉对紫色土和紫色土-黑麦草系统氮素积累、淋溶以及土壤微生物种群多样性、群落组成的影响，以期为紫色土沼液安全施用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

土壤采自西南大学国家紫色土肥力监测基地(29°49′18″ N，106°25′45″ E)，pH为7.33，有机质为21.59 g·kg-1，全氮、全磷和全钾质量含量分别为2.33、0.77和14.71 g·kg-1。采得的土壤经自然风干后，挑出碎石和植物残渣等杂质，过5 mm孔径筛备用。沼液取自重庆市某养猪场，pH为8.58，总氮、铵态氮、硝态氮和总磷质量浓度分别为611.05、565.24、38.58和76.25 mg·L-1。复合肥由邦力达农资连锁有限公司提供，总养分质量含量≥40%，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)为28∶6∶6。

1.2 试验方法

1.2.1试验装置

选取h=80 cm、Φ=20 cm的硬聚氯乙稀圆柱作为土柱，内部由下至上依次铺设孔径为120 μm尼龙网、10 cm高度石英砂(粒径为1.7 mm)、60 cm高度紫色土(容重为1.25 g·cm-3)、2 cm高度石英砂(粒径为0.88 mm，以达到均匀布水的目的)。土柱外壁从上到下每隔20 cm土层设置1个内径5 cm的取样孔，土柱底部设置直径为2 cm的取样孔配以阀门用于收集淋溶液(图1)。

1.2.2试验设计

试验设3个处理、2个对照(表1)，重复2次。各处理按等氮量原则灌溉78 d，累计灌溉量为7 800 mL，累计施氮量为1 517.88 kg·hm-2(CK2除外)。T3处理黑麦草播种量为40粒·柱-1，播种后再铺设石英砂。试验前用水饱和稳定7 d。每次灌溉前采集上一次灌溉产生的淋溶液和3层土壤样品用于分析测定。

表1 不同处理的灌溉方式

1.2.3测试指标与方法

土壤全氮含量采用常规凯氏定氮仪法测定[5]。沼液及土壤淋溶液中总氮含量采用碱性过硫酸钾消解-分光光度法测定(GB 11894—89《水质 总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》)。淋溶液硝态氮含量采用酚二磺酸光度法测定，铵态氮含量采用靛酚蓝比色法测定。

沼液灌溉结束后，采用五点法(先确定对角线的中点作为中心抽样点，再在对角线上选择4个与中心样点距离相等的点作为样点)取各处理上层土壤(0～20 cm)送往上海美吉生物医药科技有限公司进行土壤微生物Illumina MiSeq 高通量测序。所采用引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。对细菌的16S rRNA V3～V4 区进行扩增。反应体系：采用20 μL PCR反应体系，5×FastPfuButter 4 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)2 μL，上游引物(5 μmol·L-1)8 μL，下游引物(5 μmol·L-1)8 μL，FastPfupolymerase 0.4 μL，牛血清蛋白(bovineserum alblumin, BSA)0.2 μL，DNA模板10 ng，用ddH2O补充至20 μL。PCR仪采用ABI GeneAmp©9700型。PCR反应程序：细菌热循环包括在95 ℃条件下初始变性3 min，随后35个循环在95 ℃条件下变性30 s，在55 ℃条件下退火30 s，在72 ℃条件下延伸45 s，最后在72 ℃条件下最终延伸10 min。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2016进行数据统计与计算，采用IBM SPSS Statistics 23进行方差分析和多重比较(P< 0.05)，使用Origin 2018绘图。

氮素淋失率(R)计算公式为

(1)

式(1)中，Vi为第i次收集到的淋溶液体积，mL；ρi为第i次收集到的淋溶液中总氮浓度，mg·mL-1；Ni为第i次灌溉累计施氮量，mg。

采用RDP classifier贝叶斯算法对97% 相似水平的OTU(operational taxonomic units)代表序列进行分类学分析，对比silva数据库，得到每个OTU对应的物种分类信息。利用mothur(v. 1.30.1)指数进行分析，以相似度0.97进行分析得到Chao1指数、Shannon指数和Coverage指数。

Chao 1指数可指示样品物种丰富度，是用Chao1算法估计样本中OTU数的指数，其公式为

SChao1=Sobs+[n1(n1-1)]/[2(n2+1)]。

(2)

式(2)中，SChao 1为OTU估计数；Sobs为实际观测到的OTU数；n1为只含有一条序列的OTU数；n2为只含有两条序列的OTU数。

Shannon指数(HShannon)是用于估算样本中微生物多样性的指数之一。

(3)

式(3)中，Sobs为实际观测到的OTU数；ni为第i个OTU所含序列数；N为所有序列数。

各样本覆盖率(C)反映了该次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况，其计算公式为

C=1-n1/N。

(4)

式(4)中，n1为只含有一条序列的OTU数；N为抽样中出现的总序列数。

2 结果与讨论

2.1 沼液灌溉对土壤氮素积累的影响

试验发现，T1、T2和T3处理上层(0～20 cm)土壤全氮含量显著高于CK2(P<0.05)，且各处理上层土壤全氮含量随灌溉时间的增加呈现先升高再稳定后下降的趋势(图2)。其中，在试验36、54 d时T3处理土壤全氮含量最高，为2.95 g·kg-1，种植黑麦草能提高上层土壤中氮素含量。彭玲等[6]发现黑麦草栽培后果园土壤氮素主要积累在0～20 cm土层，减少了氮素的淋溶损失，有一定的保肥作用。试验78 d时，T1、T2和T3处理全氮含量较CK1降低3.00%～4.38%。沼液灌溉条件下氮素在土壤上层的积累量略低于复合肥，T3处理全氮含量迅速下降，可能是随着黑麦草的生长发育其对沼液中氮素吸收利用量大于本身的保肥能力所致。

各施肥处理中层(>20～40 cm)土壤全氮含量总体上低于上层土壤，但同样显著高于CK1。54 d时，各处理全氮含量达到最大值，其中，又以T2处理为最大。灌溉结束时，T2处理全氮含量仍最大，较CK2增长15.7%；而T1和T3处理比CK2分别提升9.06%和6.89%。这说明等量分次沼液灌溉处理有利于提升中层土壤全氮含量。

T1、T2处理和CK1底层(>40～60 cm)土壤全氮含量随着灌溉时间的增加呈逐渐上升趋势，78 d时土壤全氮含量分别比CK2高10.63%、10.70%和12.31%，T3处理全氮含量始终与CK2相当。相关研究表明施用沼液的土壤全氮残留量低于化肥处理，沼液中氮素更利于植物的吸收利用[7]。沼液中营养元素多以速效养分形式存在，为作物的生长发育提供了直接营养；同时，施用沼液能改善土壤环境，促进植物根系发育，进而促进植物对营养元素的吸收。笔者研究中，在等量沼液灌溉条件下，种植黑麦草处理全氮含量与无肥灌溉处理的差异较小，这进一步说明栽种黑麦草对土壤上层、中层氮素有较好的固定、吸收和利用效果。

在笔者试验条件下，沼液灌溉能增加紫色土中全氮含量，且在上层(0～20 cm)、中层(>20～40 cm)增加量更为明显，下层(>40～60 cm)土壤中全氮含量随着灌溉时间的增加处理间差异逐渐增大。郑健等[7]发现沼液灌溉能显著增加0～20 cm土层全氮含量，而在50～60 cm土层则无显著差异。柴彦君等[8]认为施用沼液对毛竹林土壤全氮含量没有显著影响。也有部分结果显示沼液灌溉在一定程度上能显著增加土壤全氮含量[9]。土壤全氮的变化与生物固氮、矿化、氮固持、硝化和反硝化等过程相关[10]，这些过程的影响因素也较多，且沼液成分和土壤性质有一定的不确定性，沼液还田后土壤全氮的变化过程不确定性较大。在笔者研究条件下，猪场沼液灌溉能有效提升紫色土中氮素积累，但影响氮素积累的因素如土壤类型、沼液成分等尚无一致结论，仍待进一步深入研究。

2.2 沼液灌溉对土壤氮素淋溶的影响

图3显示，T3处理、CK2淋溶液总氮(TN)含量随着灌溉的持续进行而略有上升。T1、T2处理和CK1淋溶液总氮含量则在灌溉一段时间后存在明显上升趋势。在前30 d，所有处理淋溶液总氮含量缓慢上升。36 d时，CK1淋溶液总氮含量激增，与上一次收集到的淋溶液相比，TN含量提高约1倍。T1处理淋溶液TN含量在42 d时开始迅速升高，且在72 d时超过CK1。而T2处理则从60 d后开始显示出明显的上升趋势，之前收集到的淋溶液总氮含量略低于CK2，说明通过等量多次方式进行沼液灌溉能够在一定程度上减缓土壤中氮素的淋溶损失。虽然T1、T2处理也出现了淋溶液总氮含量的激增，但比CK1出现总氮淋溶激增延迟6和24 d。T3处理淋溶液总氮含量始终低于T1、T2和CK1，与CK2基本持平，可能是黑麦草对由沼液浇灌所带来的氮素有较好的吸收利用所致。相关研究表明，沼液因其对植物根系发育的促进作用，使得其中的营养物质易于被作物吸收[11]，进而减少土壤中无机氮含量，降低氮素淋失风险。此外，由于植物蒸腾作用会吸收水分，降低了土壤含水量，通过降低水分的纵向流失减少氮素淋失。

氮素累积淋失率(图3)的变化趋势与淋溶液中总氮含量变化趋势基本吻合。在等量灌溉情况下，T1、T2和T3处理氮素累积淋失率比CK1更低。其中，T3处理氮素累积淋失率在0.8%～1.3% 之间，低于其他沼液灌溉处理，说明植物可以降低氮素损失率，提高氮素利用率。

在整个灌溉期内，铵态氮含量在前、中期保持平稳，后期逐渐上升(图3)。在48 d后，淋溶液中铵态氮含量明显升高，但仍小于3.0 mg·L-1，且远小于沼液中铵态氮含量。淋溶液中铵态氮占总氮比例最高为7.22 %，铵态氮并非氮素的主要流失形式。硝态氮含量总体上随灌溉时间的增加而增加(图3)。T1、T2处理淋溶液硝态氮含量在灌溉36 d时出现激增，与淋溶液中总氮含量变化趋势一致；灌溉54 d时各处理硝态氮含量略有下降；60 d时，T1、T2和T3处理硝态氮含量达到整个灌溉周期的最大值，随后硝态氮含量逐渐下降。淋溶液中硝态氮占总氮比例较大，最高可达97.92%，远高于淋溶液中铵态氮占淋溶总氮的比例，说明硝态氮在土壤中易随水流向下迁移。随着灌溉时间的增加，淋溶液中硝态氮含量增幅较小，而淋溶液中总氮含量大幅提升，淋溶液中硝态氮占总氮比例逐渐降低，可能是因为沼液中有机氮向下淋失造成淋溶液中总氮含量上升。

外源氮素输入量直接影响氮素的淋失风险。在等氮量条件下，复合肥处理淋失的氮素更多，沼液灌溉则可延缓氮素纵向迁移与淋失(图3)。在相同养分投入下，化肥比沼液灌溉更容易引发淋溶液富营养化[12]。土壤氮素淋溶受降雨、土壤类型、作物体系和肥料种类等多种因素影响[13]。氨氮在土壤中易被胶体吸附和被矿物晶穴固定，且在土壤硝化作用下转变为硝态氮，在土壤中积累[14]。氮素的过量施用会导致土壤体系的高净矿化和硝化作用[15]，且硝态氮带负电荷，不易被土壤胶体吸附，灌溉管理、季节降雨和土壤质地等因素共同影响硝酸盐淋失。韦高玲等[16]的研究表明，硝态氮淋失量最高可达淋失总氮量的99.3%。有研究表明在小麦-玉米轮作系统渗滤液中硝酸盐浓度和硝酸盐浸出通量均随沼液浓度增加而增加，一般在施用后10 d时达到峰值[15]。有研究表明与直接施用粪肥相比，等量沼液施用能有效减少氮素径流流失和淋溶损失[17]。也有研究显示，在无植物条件下沼液灌溉处理氮素淋失率比施用化肥处理高30%以上[18]，而笔者研究并未观测到类似现象，可能与供试沼液的成分、灌溉条件和土壤类型等有关。因此，沼液灌溉是否会加剧氮素淋溶损失，尚需更多更深入的研究。

2.3 沼液灌溉对土壤微生物的影响

2.3.1沼液灌溉对土壤微生物多样性的影响

在土壤微生物多样性方面，各处理Chao 1指数由大到小依次为T3、T1、CK1、CK2和T2(表2)，Chao 1指数越大，则样品丰富度越大，因此，T3处理土壤微生物群落丰富度最大，T1、T3处理大于CK1、CK2，T2处理最小。Shannon指数由大到小依次为CK2、T3、T1、T2和CK1(表2)。

T1、T2、T3处理土壤微生物群落物种多样性较CK1有所提高，3者土壤微生物所受扰动更小，合理的沼液灌溉能提升土壤微生物多样性。李美霖[19]采用Biolog法研究秸秆还田配施沼液条件下稻田土壤群落变化，与施用商品有机肥相比，施用沼液能显著提升稻田土壤微生物代谢活性和微生物多样性。过量的沼液灌溉可能对微生物多样性有不利影响。王飞等[20]向水稻土长期灌溉沼液，在高量(22.5 t·hm-2)施用情况下，Shannon指数显著低于对照组，土壤微生物活性降低。笔者研究中，与T1、T2处理相比，T3处理Chao 1指数和Shannon指数显著提高，说明种植黑麦草能增加土壤微生物丰富度和多样性，在一定程度上改善沼液灌溉对土壤微生物多样性和均匀度的扰动。T3处理微生物多样性、丰富度高于其他沼液处理，可能是因为沼液灌溉向土壤中提供了微生物生长所需的碳源，同时增加土壤中速效养分含量，促进植物根系生长以及根系分泌物的产生，进而提高土壤微生物数量和活性[21]。各沼液灌溉处理中，T2处理Chao 1指数和Shannon指数低于T1、T3处理；这可能与等量分次灌溉使土壤上层长期处于淹水状态有关，这种状态将对好氧细菌和兼性厌氧细菌造成一定的不利影响。余薇薇等[22]研究发现，沼液灌溉使紫色土和河沙土壤上层、中层含氧量降低，从而降低一些好氧或兼性厌氧细菌活性，微生物丰富度和多样性均降低。也有研究表明，随着沼液灌溉年限的增加，细菌群落物种丰富度和多样性均逐渐降低[23]。

2.3.2沼液灌溉对土壤微生物群落组成的影响

由OTU水平的Venn图(图4)可知，各处理OTU总数由多到少依次为T3(2 391)、CK2(2 291)、T1(2 251)、CK1(2 086)和T2(1 978)。各施肥处理中，仅T3处理高于无肥灌溉处理(CK2)；等量一次沼液灌溉处理(T1)OTU总数高于复合肥处理(CK1)；等量分次沼液灌溉处理(T2)OTU总数最低。这说明与施肥处理相比，种植黑麦草处理(T3)能有效丰富微生物种群数量，这与Chao 1、Shannon指数所反映的结果一致。所有处理共有OTU数为1 218，占各处理共有微生物OTU总数的50.94%～61.58%；不同处理条件下有2.04%～5.67%的OTU为该处理特有OTU。这说明在各处理条件下，微生物群落组成较为相似，但仍有部分微生物物种发生了一定变化，产生了不同的特有物种。宋三多[24]研究发现，沼液灌溉的土壤OTU数均高于对照组，笔者试验结果与之基本一致，仅T2处理OTU数低于对照，可能是沼液灌溉方式对土壤微生物OTU数量有一定影响。

所有处理微生物优势物种相似，基本上为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、髌骨细菌门(Patescibacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、棒状杆菌门(Rokubacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)和匿杆菌门(Latescibacteria)，但不同处理优势物种相对丰度则有所不同(图5)。

对比发现，与无肥灌溉(CK2)相比，各施肥处理放线菌门相对丰度略有提升。复合肥处理(CK1)酸杆菌门相对丰度最低。与CK1相比，沼液灌溉处理绿弯菌门相对丰度提高3.3～4.2个百分点。在3个沼液灌溉处理中，T2处理髌骨细菌门相对丰度大幅提升。

施肥强度和方式不同将影响土壤养分含量和组成，进而影响土壤微生物。施肥能显著提升放线菌门相对丰度[25]，笔者研究结果与之一致。酸杆菌门丰度与土壤有机质含量呈正相关[26]。复合肥降低了酸杆菌门丰度，可能与其成分以无机N、P和K为主有关，对土壤有机质含量影响较小；而沼液施入的同时向土壤中输入了一定的有机质，有助于提高酸杆菌门丰度。绿弯菌门更倾向于在营养充足的环境中生长[27]。沼液中营养成分丰富，有利于绿弯菌门生长，提高其相对丰度。

灌施沼液后，种植水稻、小麦和皇竹草的土壤主要菌门为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门和拟杆菌门[24]，笔者试验结果与之基本一致。沼液中主要菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、柔壁菌门(Tenericutes)、拟杆菌门、广古菌门(Euryarchaeota)、疣微菌门、变形菌门和螺旋菌门(Spirochaetae)。沼液灌溉引起土壤某些微生物相对丰度的增加可能与以下两点有关：一是来自于沼液的微生物定殖于土壤中所致；二是沼液提供了微生物繁殖所需的营养物质进而引起部分微生物相对丰度增加。

基于bray_curtis算法对各样本进行层级聚类(图6)，颜色由蓝到红分别代表距离由远到近，即样本间微生物群落组成的相似度由低到高。T2与其他处理(CK1、CK2、T1、T3)的距离较远，说明等量多次灌溉对土壤微生物群落组成的影响较大。将T2处理与其他处理进行属水平上的费舍尔精确检验，结果见图7。

与CK1，CK2，T1、T3处理相比，T2处理鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)相对丰度显著降低15.31、11.20、13.61和10.00个百分点。分别与CK2，T1、T3处理相比，T2处理norank_o__Saccharimonadales相对丰度显著提高9.72、6.98和6.37个百分点。与T1、T3处理相比，T2处理norank_c__KD4-96相对丰度无显著差异。与T1、CK2处理相比，T2处理norank_c__TK10相对丰度无显著差异。

鞘氨醇单胞菌属于好氧革兰阴性菌，等量分次沼液灌溉处理使得土壤长期处于厌氧淹水状态，不利于鞘氨醇单胞菌生长，进而使其相对丰度显著降低。土壤中脲酶活性与norank_o__Saccharimonadales相对丰度呈显著正相关[28]，且厌氧条件下可以提高土壤中脲酶活性[29]，等量分次沼液灌溉处理norank_o__Saccharimonadales相对丰度增加可能与灌溉方式引起的溶解氧含量较低有关。

3 结论

(1)在沼液灌溉前期(18 d)，3种处理方式均很快表现为氮素在土壤上层(0～20 cm)和中层(>20～40 cm)积累，仅在灌溉后期(78 d)，沼液灌溉处理才表现为下层(>40～60 cm)土壤氮素积累。

(2)在氮素淋溶方面，虽然等量一次灌溉、等量分次灌溉的淋溶液总氮含量在42、60 d时出现激增，但比大田复合肥处理出现氮淋溶激增时间延迟6、24 d；沼液灌溉条件下淋溶液硝态氮含量在灌溉60 d时达到峰值；淋溶液中硝态氮占总氮比例远高于铵态氮占总氮比例；种植黑麦草的沼液灌溉处理并未观测到氮素淋溶的激增，表明种植作物可以延缓氮素向地下水的迁移，降低氮淋失风险。

(3)土壤微生物Chao 1指数由大到小依次为T3、T1、CK1、CK2和T2；Shannon指数由大到小依次为CK2、T3、T1、T2和CK1。与施复合肥(CK1)相比，沼液灌溉能提升土壤微生物群落物种丰富度和多样性，其中，以种植黑麦草的沼液灌溉(T3)最为显著。等量分次沼液灌溉处理土壤微生物群落结构与其他处理的差异最大，T2处理显著降低鞘氨醇单胞菌相对丰度，norank_o__Saccharimonadales相对丰度显著提高。