有机溶剂提取运城盐湖嗜盐古菌中类胡萝卜素工艺条件优化研究

马国刚

（ 运城学院 生命科学系， 山西 运城 044000）

0 引言

盐湖广泛分布于世界各地， 是嗜盐古菌高度集中的极端环境。 目前， 重点被研究的盐湖有美国的大盐湖、 肯尼亚的死海和Magadi 湖[1]。 我国的盐湖主要分布在新疆维吾尔自治区、 青海省和山西运城。很多研究表明， 盐湖中存在的微生物多种多样， 嗜盐古菌就是其中一种， 其生存环境非常特殊， 必须生活在高盐的环境中， 也因此形成了其特殊的代谢体系， 目前研究已经发现， 很多极端嗜盐古菌可以产生大量的类胡萝卜素， 而且嗜盐古菌生产类胡萝卜素高效易操控。 这也是人们逐渐关注它的原因。

观察发现到山西运城盐湖湖水大面积变红， 所以从山西运城盐湖水样中分离出一株嗜盐古菌， 而它的发酵液呈浑浊红色， 含有大量的类胡萝卜素。猜测从其中提取出的类胡萝卜素含量相较于其他微生物含量多， 所以对山西运城盐湖嗜盐古菌产生的类胡萝卜素提取工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株， 取自山西运城盐湖水样中分离的一株嗜盐古菌G11。

1.2 主要试剂

（1） 培养基。 GH 培养基： 0.5%酸水解酪蛋白，0.5%蛋白胨， 1%酵母粉， 0.3%柠檬酸钠， 2%七水合硫酸镁， 0.2%氯化钾， 25%氯化钠， pH 值7.5～8.0，于121 ℃条件下灭菌。

（ 2） 试剂。 无水乙醇、 丙酮、 甲醇、 石油醚，等均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 原材料的准备

准确称取酸水解酪蛋白、 蛋白胨、 酵母粉、 柠檬酸钠、 七水合硫酸镁、 氯化钾、 氯化钠， 缓慢加蒸馏水并定容到500 mL， 搅拌， 待液体泡沫几乎没有时， 调pH 值至7.5～8.0， 制成培养基备用。

取自山西运城盐湖水样中分离的一株嗜盐古菌G11， 甘油保存于-80 ℃的冰箱中。 取上述制备的培养基， 分装到250 mL 的锥形瓶中， 按照10%的接种量将菌体接入， 温度37 ℃， 转速12 000 r/min， 振荡并光照培养10 d， 待菌液呈红色浑浊后， 停止。

取适量发酵液于离心管中， 4 ℃条件下， 以转速12 000 r/min 高速冷冻离心10 min， 收集管底菌体，蒸馏水润洗， 取得菌体后备用。

1.3.2 有机溶剂的选择

取制备得到的菌体， 选择无水乙醇、 甲醇、 石油醚、 丙酮等作为提取剂提取类胡萝卜素。 料液比1∶7，25 ℃下提取30 min 后， 4 ℃下， 以转速12 000 r/min离心10 min， 获得上清色素提取液。 重复上述步骤3 次， 到菌体出现白色为止， 取上清液。

1.3.3 单因素试验

（ 1） 不同提取时间对类胡萝卜素产量的影响。取制备得到的G11 菌体， 选用无水乙醇， 料液比1∶7， 25℃下依次浸提10， 20， 30， 40， 50 min 后，于4 ℃下以转速12 000 r/min 离心10 min， 获得上清色素提取液， 重复上述步骤3 次， 直至菌体出现白色为止， 取上清液。

（ 2） 不同提取温度对类胡萝卜素产量的影响。取制备得到的G11 菌体， 选用无水乙醇， 料液比1∶7， 分别在30， 35， 40， 45， 50 ℃下提取30 min后， 于4 ℃下以转速12 000 r/min 离心10 min， 获得上清色素提取液， 重复上述步骤3 次， 直至菌体出现白色为止， 取上清液。

（3） 不同提取料液比对类胡萝卜素产量的影响。取制备得到的G11 菌体， 选用无水乙醇， 料液比分别为1∶6， 1∶7， 1∶8， 1∶9， 1∶10， 于25 ℃下提取30 min 后， 于4 ℃下以转速12 000 r/min 离心10 min，获得上清色素提取液， 重复上述步骤3 次， 直至菌体出现白色为止， 取上清液。

（ 4） 不同提取次数对类胡萝卜素产量的影响。取制备得到的G11 菌体， 选用无水乙醇， 料液比分别为1∶7， 于25 ℃下提取30 min 后， 于4 ℃下以转速12 000 r/min 离心10 min， 获得上清色素提取液， 重复以上步骤分别1 次， 2 次， 3 次， 直至菌体出现白色为止， 取上清液。

1.3.4 正交试验

依据单因素试验结果， 以提取时间， 提取温度和料液比等因素作为考查因素， 选用三因素三水平L9（ 34）进行正交试验。 将类胡萝卜素得率作为指标，找出最优因素和水平， 最终得出类胡萝卜素得率较高的因素组合。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.3.5 类胡萝卜素得率的测定

因为在类胡萝卜素分子的结构主链存在着大量的共轭不饱和双键， 而且它的分子能够在可见光区域内有强烈的光吸收， 所以可以通过分光光度法进行定量测定。 大多数类胡萝卜素在可见光区域波长400～500 nm 处有吸收， 利用紫外分光光度计将色素提取液进行吸收光谱测定[2]。

在容量瓶中稀释色素粗提液， 将其置于比色皿中， 选择波长为475 nm， 无水乙醇为空白， 读取吸光度值， 记录数据[3]。

将所得数据代入以下公式：

式中： Y——类胡萝卜素得率， μg/g；

A——475 nm 处吸光度；

X——稀释倍数；

V——加入的提取液体积， mL；

E——消光系数， 0.16；

M——用于提取色素的嗜盐古菌菌体干重， g。

2 结果与分析

2.1 有机溶剂的选择

有机溶剂的选择见图1。

图1 有机溶剂的选择

由图1 可知， 采用无水乙醇为提取溶剂时， 类胡萝卜素得率最高； 丙酮提取产生的类胡萝卜素含量与无水乙醇产生的相近， 石油醚提取类胡萝卜素时， 提取率最低。这是因为在类胡萝卜素的分子骨架上有40 个C 原子， 存在单双键互相交替的共轭电子体系， 极易吸收别的分子能量， 而失去电子。 同时， 类胡萝卜素分子属于极性分子， 在很多有机溶剂中的溶解度较大[4-5]， 极易溶于无水乙醇与丙酮， 而比较难溶于石油醚。 无水乙醇与丙酮的提取效果不相上下， 但无水乙醇无毒， 价格比较便宜。 因此， 选择无水乙醇作为提取剂。

2.2 单因素试验

2.2.1 不同提取时间对类胡萝卜素得率的影响

不同提取时间对类胡萝卜素得率的影响见图2。

图2 不同提取时间对类胡萝卜素得率的影响

由图2 可知， 提取时间为10～20 min 时， 类胡萝卜素得率减少， 可能是由于在10 min 时嗜盐古菌的细胞壁破碎不够完全， 类胡萝卜素溶出较少， 还有大量色素残留在菌体中。 随着时间的推移， 细胞内的蛋白质和其他杂质阻碍嗜盐古菌的细胞壁破碎，导致类胡萝卜素产量在提取时间为20 min 时到达最低， 而在提取时间为20～30 min 时， 类胡萝卜素得率逐渐增加， 到30 min 时达到最大值， 可能是由于嗜盐古菌的细胞壁彻底破碎， 类胡萝卜素在有机溶剂中大量溶出， 在30～50 min 时， 类胡萝卜素产量随着时间的推移而逐渐减少， 原因是当有机溶剂作用的时间过长时， 古菌G11 的细胞壁破碎过于完全， 细胞中蛋白质、 脂质、 色素等随着类胡萝卜素的溶出而溶出， 同时类胡萝卜素分子不稳定， 极易被氧化降解， 导致类胡萝卜素得率减少。

2.2.2 不同提取温度对类胡萝卜素得率的影响

不同提取温度对类胡萝卜素得率的影响见图3。

图3 不同提取温度对类胡萝卜素得率的影响

由图3 可知， 低于40 ℃时， 随着提取温度升高， 类胡萝卜素得率增大， 当提取温度达到40 ℃时， 得率最高， 这可能是因为分子运动速度与提取温度呈正比， 温度越高， 类胡萝卜素在无水乙醇中的扩散速率越大， 类胡萝卜素的提取率也随之增大。之后， 提取温度继续增大， 类胡萝卜素得率又逐渐减小， 由于类胡萝卜素分子中有很多不饱和双键，随着温度的不断提升， 类胡萝卜素分子结构被破坏，发生降解， 得率降低。

2.2.3 不同料液比对类胡萝卜素得率的影响

不同料液比对类胡萝卜素得率的影响见图4。

图4 不同料液比对类胡萝卜素得率的影响

由图4 可知， 料液比为1∶7 时， 类胡萝卜素得率最大， 超过1∶7 后， 料液比继续增大， 类胡萝卜素得率缓慢减少。 原因是细胞浓度越低， 细胞破碎效果变好， 随着无水乙醇的增多， 嗜盐古菌的细胞浓度被稀释， 细胞破碎更彻底。 但料液比过低， 细胞壁破碎不够完全， 部分色素会堆积到一起， 从而阻碍了类胡萝卜素的扩散， 最终影响类胡萝卜素得率。 若料液比过大， 嗜盐古菌产生的类胡萝卜素产量逐渐减少， 同时细胞中的蛋白质等杂质被提取出来的可能性越大， 导致类胡萝卜素色素提取液不够纯， 吸光度值下降， 得率也随之减少。

2.2.4 不同提取次数对类胡萝卜素得率的影响

不同提取次数对类胡萝卜素得率的影响见图5。

图5 不同提取次数对类胡萝卜素得率的影响

由图5 可知， 提取次数与类胡萝卜素得率呈正相关的关系。 提取一次类胡萝卜素得率最少， 对类胡萝卜素进行提取的次数越多， 类胡萝卜素得率也越高， 原因是由于对菌体进行一次离心提取时， 并不能够把菌体中的色素完全提取出来， 离心后的菌体沉淀物还显红色， 表明还有少量色素残留在菌体中未被提取出。 然而， 提取次数越多， 所消耗的无水乙醇用量也越多， 不但浪费也增加了成本， 所以综合考虑， 将2 次作为最佳提取次数。

2.3 正交试验

从上述单因素试验中得出， 对类胡萝卜素提取率影响较大的因素有提取时间、 提取温度和提取料液比等。 所以选择提取时间、 提取温度和提取料液比进行三因素三水平L9（ 34）的正交试验。

正交试验方案见表2。

表2 正交试验方案

由表2 可知， 因素作用对指标影响的主次， 即A＞C＞B， 即料液比＞提取时间＞提取温度。 根据因素的主次确定了有机溶剂提取嗜盐古菌中类胡萝卜素的较优工艺条件为A3C3B3。 又因为选取出的最优水平A3C3B3没有在正交表中出现。 因此， A3C3B3与正交表中最优条件A1C3B3相比较， 进行验证性试验。

验证性试验见表3。

表3 验证性试验

A3C3B3的提取条件比A1C3B3的提取条件较好。所以选用较优水平A3C3B3。 即提取溶剂为无水乙醇，料液比1∶8， 提取时间40 min， 提取温度50 ℃，提取次数为2 次时， 提取效果较好。

3 结论

通过有机溶剂提取法和紫外- 可见分光光度计法对山西运城运城盐湖中嗜盐古菌所产生的类胡萝卜素进行了提取， 该方法具有设备投资费用少、 节约成本、 大批量提取可进行回收试剂、 节约试剂、减少浪费等优点。

从单因素试验得出， 影响类胡萝卜素得率的因素有提取时间、 提取温度、 提取次数和料液比。 未达到40 min 时， 类胡萝卜素得率与提取时间呈正相关， 当超过40 min 后， 两者之间又呈现负相关； 当提取温度50 ℃时， 类胡萝卜素得率先减少后增大，达到50 ℃后， 温度与类胡萝卜素得率呈负相关； 提取次数与类胡萝卜素得率呈正相关， 最佳选2 次；料液比低于1∶7 时， 类胡萝卜素得率与料液比呈正相关， 高于1∶7 时， 二者呈负相关。

从正交试验及验证性试验得出， 提取溶剂为无水乙醇， 料液比1∶8， 提取时间40 min， 提取温度50 ℃， 提取次数为2 次时， 得率最大， 从极差分析中得出， 料液比（g∶mL） 对类胡萝卜素得率影响最大， 然后是提取时间（min）， 最后是提取温度。

有机溶剂提取法方法简单、 操作省时、 环保节能， 消耗的提取剂用量较少， 若用于大规模生产，具有费用较低、 可回收试剂、 减少浪费、 降低成本等优点， 而从嗜盐古菌中提取类胡萝卜素不需要考虑环境季节等因素。 试验提取的类胡萝卜素为天然色素， 符合现阶段人们对色素的要求， 所提取的色素可用于各方各面。 试验是从运城盐湖嗜盐古菌中提取的色素， 进一步扩大了提取色素的研究范围，为以后的研究提供科学依据。