新型化合物EndiandrinA对脊髓损伤潜在治疗的研究

钱然

摘要：脊髓损伤是一种高发病率和高死亡率的疾病，而嗅鞘细胞是脊髓神经修复治疗的一种有前途的方法，并且利用天然产物可以改善嗅鞘细胞移植后的功能。我们检测了化合物Endiandrin A （End A）在神经碎片因子的存在下，对嗅鞘细胞的影响。我们发现，End A（10 mM）在存在神经碎片因子的情况下，刺激了嗅鞘细胞的增殖和迁移，证明了End A能调节嗅胶质细胞的行为，从而改善移植后的生存、增殖和迁移，从而有利于神经修复。

关键词：脊髓损伤;EndiandrinA;嗅鞘细胞

脊髓损伤（SCI）是一种高发病率和高死亡率的疾病，会导致不可逆的轴突损伤和神经元死亡，导致感觉和自主神经功能的永久性缺陷，从而导致慢性瘫痪[1]。除了最初的损伤外，一系列严重的生理并发症，包括肠、膀胱、呼吸和心脏的缺陷也是主要的威胁。。目前，脊髓损伤的治疗仍然主要是保守性的，包括处理疼痛综合征和感觉丧失并发症的临床护理。幸运的是，神经生物学研究的进展，预示着新的关键型神经保护和恢复疗法，这些治疗性干预可能会降低伤后护理的成本。

细胞治疗是治疗脊髓损伤的一种很有前途的策略，近年来，大量的动物研究表明，嗅球嗅鞘细胞（OB-OECs）和固有层嗅鞘细胞（LP-OECs）在神经系统病理学的各个区域都能促进轴突再生。这些发现包括：（1）肌萎缩侧索硬化（ALS）大鼠模型的神经保护和再髓鞘化;（2）促进中风小鼠模型神经可塑性的能力[2]和（3）神经元碎片[3]。OECs须在移植后存活，因为OECs的增殖是至关重要的。

从早期开始，富含类黄酮的食物就被认为具有神经保护作用，这种作用是由黄酮类化合物的抗氧化能力介导的。天然产物姜黄素通过增加神经碎片因子的增殖、迁移和增强其吞噬功能而成为治疗脊髓损伤的一种潜在选择，利用天然产物可以改善OECs移植后的生存、迁移和增殖功能。

材料和方法：

1. 划痕迁移试验

嗅鞘细胞的迁移通过划痕试验进行测定：在划痕试验前，嗅鞘细胞以3x103的密度被置于96孔板上48小时，以达到70%的愈合度，之后用200μl的移液管尖端在直径为1400至2000μm的无细胞区域划出划痕。用培养基清洗孔以去除细胞碎片，并在含有1%HEPES的DMEM/F12中培养12小时，在0到12小时之间，每间隔15分钟拍摄划痕。

2. 活细胞成像

所有的形态学分析、划痕迁移实验和单细胞迁移实验都是用生命细胞成像技术来进行的。OECs在含有1%HEPES的DMEM/F12培养基中生长，并且图像是在定制的37°C的温室里，不含有二氧化碳的环境下自动采集的。在Olympus IX81 Cell R显微镜上使用Hamamatsu数码相机，每10分钟获得一次12到36小时的荧光和微分干涉对比图像。为了分析活细胞成像动态图，活细胞成像实验的延时记录作为图像系列输出，并使用ImageJ进行手动分析。

结果：

与对照组相比，神经碎片因子分别在12、24、36和48小时时抑制了OEC的迁移（图1），但是，End A在浓度为10µM时，可使伤口愈合率提高68%左右。有趣的是，在有神经碎片因子存在的情况下，End A的迁移率能增加约55%（图1）。此外，延时图像表明，治疗组划痕间隙处的神经碎片因子数量减少，提示End A可能会吞噬神经碎片因子。

讨论：

我们使用延时显微镜观察了End A对OEC迁移的影响（图2），细胞运动很明显受到邻近细胞存在的影响。因此，我们用划痕试验检测了单个嗅鞘细胞的迁移，使细胞迁移到无细胞划痕中，图像显示，细胞并没有沿着直线迁移到划痕处，而是沿着一条曲折的路线迁移。为了分析活细胞成像图像，我们将活细胞成像实验的延时记录导出为一个图像序列，并使用图像J进行手动分析，以确定其空间面积，结果发现End A和神经碎片因子联合应用显著增加了细胞迁移到划痕处的距离[4]。通過使用联合应用End A和神经碎片因子，OECs的生存能力可以显著提高，并可能促进移植后OECs的迁移和增殖，对脊髓损伤有治疗帮助。

参考文献：

1. Leal-Filho， M.B.， Spinal cord injury： From inflammation to glial scar. Surg Neurol Int， 2011. 2： p. 112.

2. Katoh， H.， et al.， The dual origin of the peripheral olfactory system： placode and neural crest. Mol Brain， 2011. 4： p. 34.

3. He， B.R.， et al.， Phagocytic removal of neuronal debris by olfactory ensheathing cells enhances neuronal survival and neurite outgrowth via p38MAPK activity. Mol Neurobiol， 2014. 49（3）： p. 1501-12.

4. Kuntzsch， D.， et al.， The plant-derived glucocorticoid receptor agonist Endiandrin A acts as co-stimulator of colonic epithelial sodium channels （ENaC） via SGK-1 and MAPKs. PLoS One， 2012. 7（11）： p. e49426.