刺苋提取物体外抑石作用研究*

江凤玉，张一静，唐灵芝，柯俊芳，陈兰妹

（厦门医学院，福建 厦门 361023）

刺苋（Amaranthus spinosus L.）为苋科苋属一年生草本植物，全草入药，性甘、凉，有清热祛湿、散血消炎等疗效[1]。因其能够促进膀胱的湿热之气向外排出，能够消石通淋，刺苋用于治疗肾结石，有较好的排石疗效，且具有治疗周期短、效价高、毒副作用低等优点。刺苋的化学成分和相关活性研究文献报道较少，目前相关文献报道的活性主要集中在利尿、免疫、降温[2]、伤口创面愈合、抗菌[3]、抗炎镇痛[4]、抗氧化[5-6]等方面。

肾结石的主要组成成分草酸钙（CaOX）存在两种形式：一水草酸钙（COM）和二水草酸钙（COD），其中COM是COD的两倍[7]。张生等[8]研究证明COD外表较圆钝，黏附性不好，易于排出体外；而COM外表较尖锐，易黏附在损伤细胞表面形成结晶。笔者通过体外模拟实验，利用电子显微镜（EM）、傅里叶红外光谱（FTIR）、扫描电镜（SEM）、X射线衍射（XRD）等检测方法，观察刺苋提取物在体外是否具有抑制COM的生长聚集或促使COM向COD转化的作用，评估刺苋提取物的排石活性。

1 材料与仪器

1.1 药材 刺苋，采自福建省漳平市和平镇野外，经厦门医学院药学系中药专业鲍红娟副教授鉴定为Amaranthus spinosus L.。

1.2 仪器 Alpha1-2冷冻干燥机（德国christ）；SQP十万分之一天平（Sartorius）；ALPHA傅里叶红外光谱仪（德国Bruker）；FlexSEM 1000扫描电子显微镜（日本高新技术公司）；XRD6100 X射线衍射仪（日本高新技术公司）。

1.3 试剂 草酸钠（泰坦科学股份有限公司，批号：P1571587）；无水氯化钙（批号：2004172）、氯化钠（批号：20170313）、无水乙酸钠（批号：20170303）、氢氧化钠（批号：20200826）、石油醚（60-90）（批号：2102011）、乙酸乙酯（批号：1810091）、正丁醇（批号：1809111）、95%乙醇（批号：2002171）、盐酸（批号：20071128）均购自西陇科学股份有限公司，分析纯。

2 方 法

2.1 刺苋粗提

2.1.1 刺苋全草粗提 取刺苋全草525 g，加入5倍量的65%乙醇浸渍2 h，超声功率400 W，温度40 ℃，提取2次，每次1 h。过滤，浓缩，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行梯度萃取，浓缩得浸膏后冷冻干燥，得到4个样品组分，分别为石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层，置于干燥器中贮存。

2.1.2 刺苋根粗提 取刺苋根750 g，加入6.5倍量65%乙醇浸渍2 h，超声功率400 W，温度40 ℃，提取2次，每次1 h。过滤，合并滤液浓缩后取少量浓缩液作为醇提层，其余浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行梯度萃取，浓缩得浸膏后冷冻干燥，得到4个样品组分，分别为醇提层、石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层，置于干燥器中贮存。

2.2 溶液配制与样品制备

2.2.1 储备液的配制 溶液A的配制：精密称取无水氯化钙、氯化钠、无水乙酸钠，先用纯化水溶解，后转移至100 mL容量瓶中，定容至100 mL，摇匀。用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至5.7，配成浓度为10.0、8.5、1.0 mmol/L的CaCl2溶液。

溶液B的配制：精密称取草酸钠、氯化钠、无水乙酸钠，先用纯化水溶解，后转移至100 mL容量瓶中，定容至100 mL，摇匀。用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至5.7，配成浓度为5.0、1.5、1.0 mmol/L的Na2C2O4溶液。

2.2.2 刺苋提取液的制备 称取刺苋全草和根8个样品冷冻干燥组分各0.04 g，量取40.0 mL纯化水，制备成1 000 μg/mL提取液，过滤，用纯化水稀释配制成750、500、250、125 μg/mL的提取液，备用。

2.2.3 草酸钙对照品的配制 按邓芳等[9]的方法，量取1.1 mol/L的氯化钙溶液、0.2 mol/L的氯化钠溶液和适量的纯化水于干净的烧杯中，搅拌均匀后加0.033 mol/L的草酸钠溶液，使最终溶液中c（Ca2+）=c（C2O42-）=11.0 mmol/L，搅拌反应20 min，密封，陈化12 h。

将陈化好的草酸钙溶液用0.22 μm微孔过滤膜过滤，得草酸钙沉淀，真空干燥，40 ℃，过夜，得空白对照品。

2.2.4 草酸钙样品的配制 取干净烧杯，分别加入1.1 mol/L的氯化钙溶液，浓度为1 000、750、500、250、125 μg/mL的刺苋根提取物及适量的纯化水，参考草酸钙对照品的配制，得草酸钙样品。

2.3 刺苋提取物体外抑石作用研究 将制备得到的草酸钙对照品和草酸钙样品进行EM、SEM、FTIR、XRD分析，通过FTIR检测COD红外特征峰（νs 1 324 cm-1和νas 1 646 cm-1）进行定性分析，XRD检测COD晶面（200）进行定量分析。

2.3.1 电子显微镜法观察 24孔板中加入475 μL溶液A，50 μL的1 000 μg/mL刺苋全草水层提取液，475 μL的溶液B，制成不同摩尔比的草酸钙溶液[10]。以含有50 μL纯化水的样品代替刺苋提取物作为空白对照。置于不同倍数的显微镜下观察，并对晶体大小、形状和密度进行定性分析。

2.3.2 SEM观察草酸钙晶体的外部形态结构 参考文献[11]，制备草酸钙晶体，量取0.01 mol/L的氯化钙溶液、0.2 mol/L的氯化钠溶液及适量的纯化水，待搅拌均匀后，加0.01 mol/L的草酸钠溶液，使c（Ca2+）=c（C2O42-）=1.00 mmol/L，搅拌反应20 min，超声功率100 W，温度30 ℃，15 min，得样品溶液。

在培养皿中放大小相当的圆形滤纸，用镊子夹取5 mm×5 mm的单晶硅片，光亮面朝上，放于滤纸中央，用1～2滴无水乙醇清洗硅片，待干后加入上述溶液50 μL，自然晾干，得草酸钙样品。进行SEM观察，电压10 kV。

2.3.3 XRD的测试条件 参照胡鹏等[12]的XRD测试条件：Cu靶，Kα辐射，40 kV，20 mA；狭缝：DS，1°，RS，0.15 mm，SS，1；扫描速度：8（°）/min，扫描范围：2θ为5°～60°。

2.3.4 COD百分含量计算 按照文献[13]的实验方法，用COD(%)=ICOD/（ICOM+ICOD)×100%计算样品中COD的百分含量，式中ICOM为COM（101）晶面的强度，ICOD为COD（200）晶面的强度。

3 结果与讨论

3.1 EM结果分析 空白对照品中，随着溶液中Ca/Ox摩尔比的减少，生成的草酸钙晶体数量增加，且晶形也不同。（见图1～8）刘虹等[14]的研究也表明，草酸盐浓度对草酸钙的形成影响更大。在空白对照品中分别加入1 000 μg/mL刺苋全草水层提取物后，可以发现所形成的草酸钙晶体相应的数量增加，但晶形聚集变小，聚集形状由尖锐变为较圆钝。由此可见，刺苋全草水层提取物具有一定的抑制草酸钙晶体生长和聚集的作用。由ZARIN M A等[15]的研究结果可推测刺苋全草水层提取物中可能含有皂苷、黄酮苷等成分。

图1 空白对照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 图

图2 1000μg/mL全草水层[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM图

图3 空白对照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=8.5∶1.5]EM 图

图4 1000μg/mL全草水层[c(Ca2+):c(C2O42-)=8.5∶1.5]EM图

图5 空白对照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 图

图6 1000μg/mL全草水层[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=10∶1]EM图

图7 空白对照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 图

图8 1000μg/mL全草水层[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=1∶5]EM图

3.2 草酸钙对照品结果分析

3.2.1 SEM结果分析 由文献[8]可知，草酸钙晶体的SEM图像，COM多为外表棱角分明的六角形状，COD为较圆钝的四边形椎体。本实验制备的草酸钙晶体对照品中大多为COM。（见图9）

图9 草酸钙晶体对照品的SEM 图

3.2.2 FTIR结果分析 在COM和COD的标准红外光谱图中，在3 000～3 600 cm-1处的宽峰由O-H的伸缩振动引起，其中COM分裂成5个小峰，而COD为1个大峰，强度比COM强，主要是因为COD比COM多含有1个H2O。草酸根（COO-）的对称伸缩振动νs（COO-）分别为1 316 cm-1和1 324 cm-1，反对称伸缩振动νas（COO-）分别为1 620 cm-1和1 646 cm-1。指纹区COM的吸收带出现在949 cm-1、885 cm-1和663 cm-1，COD则出现在912 cm-1和611 cm-1处[17]。（见图10）

图10 一水草酸钙（上）和二水草酸钙（下）的标准IR 谱图[16]

经FTIR定性，草酸钙对照品草酸根（COO-）的对称伸缩振动νs（COO-）与COD的对称伸缩振动峰相似，而反对称伸缩振动νas（COO-）主要存在COM的反对称伸缩振动峰，指纹区出现COM的吸收峰663 cm-1，说明草酸钙对照品中同时存在COM和COD，以COM为主。（见图11）

图11 草酸钙对照品IR 图

3.2.3 XRD结果分析 由文献[7]可知，COM主要晶面为（101）、（020）、（202）、（130），COD主要晶面为（200）、（211）、（400）、（213）。草酸钙对照品的XRD图中以COM晶面为主要存在形式。（见图12）

图12 草酸钙对照品XRD 图

因此，综上可以确定草酸钙对照品中的主要成分主要为COM。本实验拟通过FTIR和XRD，将草酸钙样品与草酸钙对照品进行比较，观察刺苋根提取物是否可以抑制草酸钙晶体中COM的生长或诱导COD的形成，探究其是否存在抑石作用。

3.3 草酸钙样品结果分析

3.3.1 FTIR结果分析 FTIR测定结果发现，4个刺苋根提取物的5个不同浓度FTIR结果相差不大，结合XRD结果，分别从中选取一个作用较明显的浓度进行比较。（见图13～16）

图13 醇提层样品500 μg/mL IR 图

图14 正丁醇层样品500 μg/mL IR 图

图15 乙酸乙酯层样品1 000 μg/mL IR 图

图16 石油醚层样品1 000 μg/mL IR 图

将草酸钙对照品与草酸钙样品的FT-IR谱图进行对比，结果见表1。

表1 不同草酸钙样品的FT-IR 检测结果

由表1可知，刺苋根4个不同部位提取物制备的草酸钙样品的对称伸缩振动νs（COO-）无明显差异，与COD的对称伸缩振动峰相似。而反对称伸缩振动νas（COO-），正丁醇层和石油醚层显示COD伸缩振动峰，醇提层和乙酸乙酯层无显著区别，主要与COM的伸缩振动峰相似。

由FTIR谱图结果可知，刺苋根的4个不同部位提取物制备得到的草酸钙样品，均存在COD的特征峰，说明刺苋根提取物可以诱导COD的生成，具有一定的抑石活性。

3.3.2 XRD结果分析 根据COD（%）=ICOD/（ICOM+ICOD）×100%计算COD的百分含量，结果见表2。

表2 不同草酸钙样品所含COD 的含量

由表2可知，刺苋根的4个不同部位提取物制备的草酸钙样品中含有一定量的COD，且随着浓度的增加，诱导生成的COD百分含量增加。由XRD图可以看出，草酸钙样品中均以COM晶面为主要存在形式，COD晶面仅少量存在。（见图17～18）由此可见，刺苋根的4个不同部位提取物均有一定程度的诱导COD晶体形成的作用，但作用并不显著。

图17 醇提层500 μg/mL XRD 图

图18 石油醚层1 000 μg/mL XRD 图

4 结 论

肾结石是泌尿系统的常见病，草酸钙结石在肾结石中最常见[18]，本实验采用EM、FTIR、XRD、SEM等方法比较研究了刺苋根4个不同部位提取物对草酸钙晶体生长的调控作用。研究表明，4个不同部位的刺苋根提取物有一定的抑制草酸钙晶体成核和生长，以及诱导COD晶体形成的作用，但作用不显著。结合本课题组的前期研究[19]，在以小鼠为实验对象建立的体内草酸钙结石损伤模型中，刺苋根正丁醇层提取物表现出明显的排石活性，可以发现刺苋提取液的排石活性机制可能主要为利尿作用，抑石作用较为微弱。