基于Wnt/β-catenin信号通路益气活血法对局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用及机制研究

马小晴，郎丰龙，赵 爽，张 强

（抚顺市中心医院，辽宁 抚顺 113006）

缺血性脑血管病多发于中老年人，发病率、致残率和病死率均较高，如未及时治疗，可导致脑组织不可逆损伤，及时治疗后患者仍有复发可能，且多数患者留有偏瘫、失语等后遗症，给社会和家庭带来了沉重负担[1-2]。临床上治疗缺血性脑血管病主要通过重建血流，恢复缺血区血液供应以减少脑损伤。近年临床研究发现，缺血性脑组织血管自然再通或经溶栓治疗恢复血流后，再灌注的血流可引起一系列级联反应，从而加重脑组织损伤，导致脑组织缺血再灌注损伤[3]。补阳还五汤是临床治疗缺血性脑血管病常用方剂之一，有益气活血之功效，血塞通主要成分为三七总皂苷，有活血祛瘀、通脉活络等作用[4-5]。补阳还五汤和血塞通用于治疗缺血性脑血管病已有文献报道[6-7]，但两者合用对于缺血再灌注损伤的报道较少。本研究通过建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，模拟缺血再灌注损伤导致的脑梗死过程，观察补阳还五汤联合血塞通的益气活血法对局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用，并探讨其作用机制，以期为临床治疗缺血性脑血管病提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄SPF级健康雄性SD大鼠114只，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。大鼠购入后于通风环境，温度（23±2）℃，湿度（50±5）%，明暗周期12 h/12 h循环，适应性饲养1周。本实验经抚顺市中心医院医学实验动物管理委员会审批通过。

1.2 药物与试剂 注射用血塞通冻干粉（黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，国药准字Z20026437，规格：400 mg，批号：20170603）；补阳还五汤煎液（本院自制）；TTC染色液（2%）（北京索莱宝科技有限公司，货号：G3005）；兔抗大鼠无翅型MMTV整合位点家族成员3a（wingless-type MMTV integration site family member 3a，Wnt3a）单抗（货号：ab219412）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）单抗（货号：ab93926）、β-连环蛋白（β-catenin）单抗（货号：ab184919）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）单抗（货号：ab134175）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）多抗（货号：ab196495）、Bax单抗（货号：ab182733）、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（货号：ab6721）均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 101-1A烘箱（上海坤天实验室仪器有限公司）；SLAN-96P/SLAN-96S/48P实时荧光定量PCR仪（上海宏石医疗科技有限公司）；DYCZ-20H型高通量垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 造模与分组 取80只大鼠，禁食不禁水12 h，采用大脑中动脉栓塞法[8]建立局灶性脑缺血再灌注模型。1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定，纵切左侧颈部正中部位皮肤暴露颈总动脉，分离颈外和颈内动脉，结扎颈外动脉远心端，夹闭颈内动脉、颈总动脉，将线栓自颈总动脉向颅内方向插入，插入深度18～20 mm至出现阻力，结扎线栓切口下方，松开动脉夹。术后大鼠加电热毯保暖，记录缺血开始时间，2 h后缓慢拔出线栓，缝合伤口，使用适量抗生素以防感染。另取17只大鼠为假手术组，手术方法同上，仅暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，然后逐层缝合皮肤。剩余17只大鼠为空白组，不做任何处理。

建模成功标准：待大鼠清醒后，参照Longa等[9]的方法对大鼠神经功能缺损进行评分，剔除手术过程中死亡大鼠，神经功能缺损评分2～3分纳入实验。建模成功大鼠共69只，随机分为模型组17只，血塞通组17只，补阳还五汤组17只、联合组18只。

1.5 实验给药 神经缺损评分完毕后，根据动物与人体等效剂量换算[10]，进行给药。注射用血塞通冻干粉采用专用溶剂溶解后以5%葡萄糖注射液稀释至质量浓度为10 mg/mL备用；补阳还五汤方药组成：黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍5 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g，用双蒸水浸泡4 h，水煎2次（加水量分别是药材质量混度的10倍、8倍，煎煮时间分别为2、1 h），合并煎液浓缩至生药质量浓度为2 g/mL，pH值调至7.0备用。给药方法：血塞通组大鼠尾静脉注射血塞通溶液（50 mg/kg）+灌胃生理盐水（10 mL/kg）；补阳还五汤组大鼠尾静脉注射5%葡萄糖注射液（5 mL/kg）+灌胃补阳还五汤煎剂（20 g/kg）；联合组大鼠尾静脉注射血塞通溶液（50 mg/kg）+灌胃补阳还五汤煎剂（20 g/kg）；空白组、假手术组和模型组大鼠尾静脉注射5%葡萄糖注射液（5 mL/kg）+灌胃生理盐水（10 mL/kg），1次/d，连续给药7 d。

1.6 观察指标

1.6.1 神经功能缺损评分 分别于缺血再灌注后1、3、7 d，每次干预后2 h，对各组大鼠进行神经功能缺损评分，评分方法同前。

1.6.2 大脑含水量 末次干预后2 h，每组随机选取6只大鼠，脱颈处死，断头取脑，用滤纸擦干脑组织表面血迹，进行称重，为脑湿质量，之后110 ℃烘箱中烘干再次称重，为脑干质量，脑含水量=（脑湿质量-脑干质量）/脑湿质量×100%。

1.6.3 脑梗死体积 末次干预后2 h，每组随机取6只大鼠，脱颈处死后取脑，去除嗅球和小脑，自额极开始间隔2 mm使用切刀连续切取5张冠状脑片-20 ℃保存。放入TTC染色液中，37 ℃避光染色，两面分别染色10～15 min后，4%多聚甲醛中固定过夜。TTC染色后，梗死大脑区域因无法着色呈现白色，正常脑组织呈红色，观察拍照，采用Image-Pro Plus 6.0图像软件测量梗死区域面积，脑梗死体积=脑梗死面积×切片厚度（2 mm），分析脑梗死体积百分比，脑梗死体积百分比=脑梗死体积/全脑体积×100%。

1.6.4 脑组织Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相对表达量 末次干预后2 h，脱颈处死各组剩余大鼠，取脑保存于液氮中。取液氮保存脑组织70 mg，采用Trizol法提取总RNA，检测样品RNA浓度和纯度，按照反转录试剂盒说明书反转录cDNA。反应体系：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶10 μL，双蒸水7 μL。反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共35个循环。以GAPDH为内参基因，按照2-△△CT计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6.5 脑组 织Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量 取液氮保存脑组织70 mg，冰上裂解，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。100 ℃加热5 min进行蛋白变性，制备蛋白上样液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭2 h，将膜分别与1:1 000稀释的Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、Axin2、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗4 ℃封闭过夜，洗膜，加入1:4 000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗，常温摇床孵育2 h，加入ECL发光液，曝光。采用Image J软件分析图像，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示，各组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。重复计量资料比较采用重复测量方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 空白组和假手术组大鼠未见神经功能缺损症状。不同再灌注时间（1、3、7 d）之间大鼠神经功能缺损评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应，4组均如此；模型组大鼠神经功能缺损评分随着时间延长而升高（P＜0.05），血塞通组、补阳还五汤组和联合组大鼠神经功能缺损评分随着时间延长而降低（P＜0.05）。4组大鼠神经功能缺损评分总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应。与模型组比较，血塞通组、补阳还五汤组和联合组大鼠1、3、7 d神经功能缺损评分均降低（P＜0.05）；联合组大鼠1、3、7 d神经功能缺损评分均低于血塞通组和补阳还五汤组（P＜0.05）。时间因素与分组因素间存在交互效应（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较（，分）

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较（，分）

注：F时间主效应=21.326，P时间主效应=0.000；F分组主效应=52.469，P分组主效应=0.000；F交互效应=18.497，P交互效应=0.000；与模型组比较，aP＜0.05；与血塞通组比较，bP＜0.05；与补阳还五汤组比较，cP＜0.05；与同组内1 d比较，dP＜0.05；与同组内3 d比较，eP＜0.05

2.2 各组大鼠大脑含水量和脑梗死体积百分比比较 假手术组大鼠大脑含水量与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组和假手术组比较，模型组大鼠大脑含水量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，血塞通组、补阳还五汤组和联合组大鼠大脑含水量和脑梗死体积百分比均明显降低（P＜0.05）；联合组大鼠脑梗死体积百分比低于血塞通组和补阳还五汤组（P＜0.05）。（见图1、表3）

图1 各组大鼠脑切片TTC 染色

表3 各组大鼠大脑含水量和脑梗死体积百分比比较（，%）

表3 各组大鼠大脑含水量和脑梗死体积百分比比较（，%）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与假手术组比较，bP＜0.05；与模型组比较，cP＜0.05；与血塞通组比较，dP＜0.05；与补阳还五汤组比较，eP＜0.05

2.3 各组大鼠脑组织Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相对表达量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比较 假手术组大鼠脑组织Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相对表达量和Bcl-2 mRNA/Bax mRNA与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组和假手术组比较，模型组大鼠脑组织Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相对表达量均升高，GSK-3β mRNA相对表达量及Bcl mRNA-2/Bax mRNA均降低（P＜0.05）；与模型组比较，血塞通组、补阳还五汤组和联合组大鼠脑组织Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相对表达量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA均升高，GSK-3β mRNA相对表达量均降低（P＜0.05）；与血塞通组和补阳还五汤组比较，联合组大鼠脑组织Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相对表达量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA均升高，GSK-3β mRNA相对表达量降低（P＜0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠脑组织Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA 相对表达量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA 比较（）

表4 各组大鼠脑组织Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA 相对表达量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA 比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与假手术组比较，bP＜0.05；与模型组比较，cP＜0.05；与血塞通组比较，dP＜0.05；与补阳还五汤组比较，eP＜0.05

2.4 各组大鼠脑组织Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax比较 假手术组大鼠脑组织Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量和Bcl-2/Bax与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组和假手术组比较，模型组大鼠脑组织Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量升高，GSK-3β蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax降低（P＜0.05）；与模型组比较，血塞通组、补阳还五汤组和联合组大鼠脑组织Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax均升高，GSK-3β蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）；与血塞通组、补阳还五汤组比较，联合组大鼠脑组织Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax均升高，GSK-3β蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。（见表5、图2）

图2 各组大鼠脑组织Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1、Bcl-2、Bax 蛋白表达Western blotting 图

表5 各组大鼠脑组织Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax 比较（）

表5 各组大鼠脑组织Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax 比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与假手术组比较，bP＜0.05；与模型组比较，cP＜0.05；与血塞通组比较，dP＜0.05；与补阳还五汤组比较，eP＜0.05

3 讨 论

缺血性脑血管病的发病多与血栓形成有关，由于流向大脑的血流供应不足或中断，引起脑组织局部缺血缺氧，破坏血脑屏障通透性，造成脑组织水肿，最终导致缺血性坏死。缺血性脑血管病目前尚无特效疗法，临床上通常采用溶栓或机械性碎栓进行治疗，可有效减轻脑损伤，但由于“时间窗”等因素限制，以及溶栓后血流再灌注容易引起脑出血等并发症，导致病情恶化，损伤加重[11-12]。本研究成功建立局灶性脑缺血再灌注模型，实验过程中假手术组各项指标改变与空白组比较无明显差异，证实造模手术方式对脑组织无明显损伤。

中医学认为气虚血瘀、脑脉阻滞是导致缺血性脑血管病的基本病机，因气虚而致血瘀，致使经脉瘀塞不通，血流不达于脑部，形成缺血性脑损伤[13]。采用益气活血法可以从整体上改善和保护缺血引起的脑组织损伤，气盛而脉络通，使利脑之气血供养得以恢复，从而发挥对脑组织的保护作用[14]。补阳还五汤由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁组成，重用黄芪补气，兼用少量活血化瘀药配伍，共奏补气活血通络之功效，主治气虚血瘀之中风。血塞通主要成分为三七提取物，有活血祛瘀、通脉活络作用，可扩张脑血管、增加血流量，改善缺血受损的脑组织。两者联合应用有益气活血功效，可加强益气，去除瘀血，调和气血，消除病因，从而改善患者临床症状，发挥脑保护作用。本研究联合组大鼠神经功能缺损评分、大脑含水量明显降低，脑梗死体积明显减小，提示采用补阳还五汤联合血塞通的益气活血法治疗缺血再灌注引起的脑损伤，效果明显。研究发现，益气活血法可有效减轻小鼠肺缺血再灌注损伤，保护受损肺组织[15]。临床研究显示，益气活血法可明显改善缺血性脑卒中患者恢复期临床症状及功能缺损，综合疗效显著[16]。气虚是中风致病之根源，气行则血行，气滞则血滞，益气则气行，活血则瘀除。益气活血，使气血和畅，则脑府得养，神明自复。

细胞凋亡在缺血再灌注损伤中发挥了重要作用，经典Wnt/β-catenin信号通路参与细胞增殖分化，与缺血再灌注损伤关系密切。Wnt是一个富含半胱氨酸的脂质修饰糖蛋白家族，Wnt3a可促进细胞的分裂、加速分化增殖，是信号通路中重要的激活剂。β-catenin是一种细胞骨架蛋白，参与调节细胞分化、增殖。GSK-3β是β-catenin上游的关键酶，通过对β-catenin磷酸化，维持其在细胞内的低表达量。CyclinD1是β-catenin的下游靶基因，是细胞周期增殖信号的关键蛋白。无Wnt蛋白存的情况下，GSK-3β可使β-catenin在Axin中磷酸化，通过泛素化的方式被蛋白酶降解；存在Wnt蛋白时，其与受体Fre结合后激活Wnt/β-catenin 信号通路，GSK-3β 被磷酸化而失活，β-catenin的降解途径被阻断，导致其在胞浆累积而进入细胞核，激活下游CyclinD1，促进细胞增殖或活化[17]。Bcl-2基因是细胞凋亡的重要基因之一，可以抑制细胞凋亡，Bax为Bcl-2同源基因，促进细胞凋亡，Bcl-2/Bax常用来衡量细胞凋亡情况[18]。本研究结果显示，联合组大鼠脑组织Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA及蛋白水平降低，GSK-3β mRNA及蛋白水平升高，Bcl-2/Bax升高，提示Wnt/β-catenin信号通路被激活，可抑制细胞凋亡，促进细胞存活，有利于减轻大鼠脑组织缺血再灌注损伤。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路激活，可提高心肌细胞存活率，减轻心肌缺血再灌注损伤[19]。另有研究显示，调节GSK-3β介导的Wnt/β-catenin途径，诱导细胞抗凋亡促存活，可减轻缺血再灌注引起的肝损伤[20]。Wnt/β-catenin信号通路在缺血再灌注中发挥重要作用，与本研究结果一致，提示Wnt/β-catenin信号通路激活可抑制细胞凋亡，促进细胞存活，有效减轻缺血再灌注引起的脑损伤。

综上所述，血塞通联合补阳还五汤的益气活血法对缺血再灌注大鼠有脑保护作用，其机制可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制细胞凋亡，促进细胞存活，从而减轻缺血再灌注引起的脑损伤，发挥脑保护作用，可为临床治疗缺血性脑血管病提供理论参考。