蒲公英甾醇通过NOD1/NF-κB通路对Hp相关性胃炎脾胃湿热证小鼠改善作用研究*

李翰嵩，贾纯亮，梁 磊，张 磊，王 剑，刘远廷

（唐山市人民医院，河北 唐山 063000）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种定植于胃黏膜上皮细胞的慢性致病菌，可引起功能性消化不良、胃癌前病变（胃异型增生、肠黏膜化生等）和胃癌[1-2]。Hp因参与胃癌的发展，被WHO归为Ⅰ类致癌物[3]。Hp感染后胃黏膜发生炎症改变称为Hp相关性胃炎（Hp associated gastritis，HAG），临床上以脾胃湿热证症状最为常见[4]。核苷酸结合寡聚化结构域1（nucleotide binding oligomerization domain1，NOD1）是一种重要的模式识别受体，可识别并结合病原相关分子模式，激活核因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB）信号通路，诱导大量促炎性细胞因子分泌，使机体发生炎症反应[5]。蒲公英甾醇是从中药蒲公英中分离的一种五环三萜化合物，具有抗炎、抗肿瘤活性，可通过调控NF-κB通路抑制炎症反应，被用于多种炎症相关疾病的治疗[6-7]。目前，蒲公英甾醇对脾胃湿热证HAG的临床治疗研究较少，因此本研究拟通过建立脾胃湿热证HAG模型，探讨蒲公英甾醇对脾胃湿热证HAG小鼠的炎症抑制作用及机制，以期为蒲公英甾醇相关药物研发及脾胃湿热证HAG的临床治疗提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄健康SPF级C57BL/6小鼠80只，雌雄各半，体质量（22±4）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002。SPF级环境饲养，温度20～25 ℃，相对湿度45%～55%，亮暗循环时间比1∶1，自由饮食、饮水，适应性饲养7 d。实验严格遵循《实验动物管理条例》，确保动物福利伦理，经医学实验动物管理委员会审核批准。

1.2 药物与试剂 蒲公英甾醇（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20940，HPLC≥98%）；Hp菌种（美国ATCC公司，编号：700392）；NOD1激动剂二氨基庚二酸（γ-D-glu-mesodiaminopimelic acid，iE-DAP）（美国InvivoGen公司，批号：20190312）；快速尿素酶检测试剂盒（上海国药生物公司）；兔抗鼠p65、p-p65抗体（美国Santa Cruz公司，批号：20190122）；兔抗鼠β-actin抗体（英国Abcam公司，批号：20181106）；小鼠干扰素诱导蛋白10（IFN-γ-inducible protein 10，IP-10）ELISA试剂盒（批号：20190207）、小鼠干扰素β（interferon β，IFN-β）ELISA试剂盒（批号：20181223）均购自深圳欣博生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 SY96A型全自动酶标仪（芬兰雷勃公司）；LV150N型光学显微镜（日本Nikon公司）；CFX96型荧光定量PCR仪、1658033型电泳仪（美国Bio-rad公司）。

1.4 造模与分组[8]80只C57BL/6小鼠随机分为正常组（17只）和造模组（63只）。采用复合病因（肥甘饮食+湿热环境+Hp菌液）方法制备脾胃湿热证HAG小鼠模型。造模组小鼠给予高脂饲料自由饮食，12 d后开始置于湿热箱饲养，温度（32±2）℃，相对湿度95%，6 h/d，17 d后开始灌胃Hp菌液，1×109CFU/mL，0.2 mL/d，每2 d感染1次，共5次，定植2周，感染及定植Hp期间继续给予高脂饲料及湿热箱饲养；正常组小鼠给予正常饮食+常规环境+同步饲养。第37天正常组及造模组分别随机选取5只、15只小鼠，断头处死后取胃黏膜组织进行快速尿素酶试验及HE染色。小鼠反应迟钝、精神不振、毛发松弛无光泽、喜聚少动、肛温升高、体质量减轻、大便稀软、快速尿素酶试验结果阳性及HE染色结果显示脾胃湿热证慢性浅表性胃炎,提示造模成功。将剩余的48只造模小鼠按照随机数字表法分为模型组、蒲公英甾醇组、iE-DAP组、蒲公英甾醇+iE-DAP组，每组12只。

1.5 实验给药 蒲公英甾醇组小鼠灌胃蒲公英甾醇[9]（生理盐水配制），2.5 mg/kg，1次/d，连续灌胃4周；iE-DAP组小鼠腹腔注射iE-DAP，100 μg/只[10]，1次/周，连续注射4周；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠灌胃蒲公英甾醇，2.5 mg/kg，1次/d，腹腔注射iE-DAP，100 μg/只，1次/周，连续给药4周；正常组和模型组小鼠灌胃、腹腔注射等体积生理盐水。

1.6 观察指标

1.6.1 小鼠一般情况 实验过程中观察各组小鼠精神状态、大便性状、饮水、饮食、体质量、肛温、毛色及皮毛顺滑度等。

1.6.2 小鼠血清IP-10和IFN-β水平 药物干预结束后次日，脱颈处死各组小鼠，采集下腔静脉血，室温静置1 h，3 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，上清即为血清样品。酶标板设置空白孔、标准品孔和样品孔，空白孔不加样品，标准品孔加不同浓度标准品，样品孔先后加40 μL样品稀释液和10 μL血清样品，晃动混匀后封板，37 ℃孵育0.5 h，清洗液洗涤5次，吸水纸上拍干，除空白孔外，每孔各加50 μL酶标试剂，混匀后封板，37 ℃孵育1 h，清洗液洗涤5次，拍干，每孔加100 μL TMB显色液轻轻震荡混匀，37 ℃避光20 min，标准品孔前5孔出现颜色梯度变化时，加50 μL终止液终止显色反应，以空白孔调零，450 nm波长测量吸光度值（OD值），根据标准品浓度绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.6.3 Hp定植率 取小鼠胃组织，称质量后加入PBS于匀浆器中匀浆，取100 μL匀浆液按照快速尿素酶检测试剂盒说明书操作步骤进行检测，溶液在15 min内颜色由黄色变为粉红色或红色，尿素酶实验阳性；溶液仍为黄色则尿素酶实验阴性。匀浆液梯度稀释后于哥伦比亚培养平板（含抗生素）上，37 ℃培养7 d，对平板上Hp菌落数量计数，以lgCFU与胃组织质量比值表示Hp定植，记为lgCFU/g。

1.6.4 小鼠胃黏膜组织病理学变化 取部分胃组织，10%甲醛固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片机进行组织切片（厚度为4 μm），60 ℃烤片12 h，二甲苯脱蜡，酒精水化，苏木精-伊红（HE）染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察胃黏膜炎症情况。

1.6.5 小鼠胃组织中NOD1 mRNA和受体相互作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，RIP2）mRNA的表达水平 取50 mg胃组织，加液氮研磨，采用Trizol试剂提取总RNA，超微量分光光度计检测总RNA浓度和纯度，将RNA反转录为cDNA。PCR反应体系：10 μL 2×SYBR Green Master Mix，1 μL 2.5 μmol/L上下游引物，2 μL cDNA，6 μL DEPC-ddH2O；反应程序：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性15 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸45 s，循环40次。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次。qPCR引物使用premier 6.0设计，序列见表1。

表1 引物序列

1.6.6 小鼠胃黏膜组织p65、p-p65蛋白的表达水平 取100 mg胃组织，加液氮研磨后提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。95 ℃使蛋白变性，10%SDS-PAGE电泳，80 V恒压电泳30 min，100 V恒压电泳约1 h（溴酚蓝接近胶板底端），转膜仪将蛋白转至PVDF膜上，300 mA恒流转膜1 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别用p65、p-p65和β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜10 min×3次，HRP标记的二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，加ECL发光液于暗室中曝光显影。实验重复3次，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值的比值，作为目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件进行分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠一般情况 正常组小鼠精神状态良好，小便、大便、饮水和饮食正常，体质量逐渐增加，肛温基本恒定，皮毛光泽顺滑；造模组小鼠在建模过程中出现精神不振，懒动，反应迟钝，小便黄，大便稀软，饮水减少，食欲下降，体质量减轻，皮毛松弛无光泽等脾胃湿热证表现。蒲公英甾醇组小鼠灌胃开始后精神状态好转，活动量增加，小便颜色变淡，大便逐渐成形，饮水、饮食量增加，体质量高于模型组，肛温低于模型组；iE-DAP组小鼠较模型组脾胃湿热证症状加重，蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠较iE-DAP组脾胃湿热证症状明显减轻。

2.2 各组小鼠血清IP-10、IFN-β水平比较 模型组小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明显高于正常组（P＜0.05）；蒲公英甾醇组小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明显低于模型组（P＜0.05）；iE-DAP组小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明显高于模型组（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明显高于蒲公英甾醇组（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明显低于iE-DAP组（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠血清IP-10、IFN-β 水平比较（）

表2 各组小鼠血清IP-10、IFN-β 水平比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与蒲公英甾醇组比较，cP＜0.05；与iE-DAP组比较，dP＜0.05

2.3 各组小鼠Hp定植率比较 蒲公英甾醇组小鼠Hp定植率低于模型组（P＜0.05）；iE-DAP组小鼠Hp定植率高于模型组（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠Hp定植率高于蒲公英甾醇组（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠Hp定植率低于iE-DAP组（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组小鼠Hp 定植率比较（，lgCFU/g）

表3 各组小鼠Hp 定植率比较（，lgCFU/g）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与蒲公英甾醇组比较，bP＜0.05；与iE-DAP组比较，cP＜0.05

2.4 各组小鼠胃黏膜组织病理变化 正常组小鼠胃黏膜上皮结构完整、腺体排列整齐、无炎症细胞浸润及充血肿胀；模型组小鼠胃黏膜充血肿胀、上皮结构破坏，腺体结构萎缩、排列无序，固有层有炎症细胞浸润；蒲公英甾醇组小鼠胃黏膜表面光滑、腺体排列整齐、少部分轻度充血水肿、炎症细胞浸润较模型组明显减轻；iE-DAP组小鼠胃黏膜组织病理损伤程度较模型组加重；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠胃黏膜组织病理损伤较iE-DAP组明显减轻。（见图1）

图1 各组小鼠胃黏膜组织病理学变化（HE，×200）

2.5 各组小鼠胃组织中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA表达水平比较 模型组小鼠胃组织NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相对表达量均明显高于正常组（P＜0.05）；蒲公英甾醇组小鼠胃组织中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相对表达量均明显低于模型组（P＜0.05）；iE-DAP组小鼠胃组织中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相对表达量均明显高于模型组（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠胃组织中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相对表达量均明显高于蒲公英甾醇组（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠胃组织中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相对表达量均明显低于iE-DAP组（P＜0.05）。（见表4）

表4 各组小鼠胃组织中NOD1 mRNA、RIP2 mRNA表达水平比较（）

表4 各组小鼠胃组织中NOD1 mRNA、RIP2 mRNA表达水平比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与蒲公英甾醇组比较，cP＜0.05；与iE-DAP组比较，dP＜0.05

2.6 各组小鼠胃黏膜组织p65、p-p65蛋白表达水平比较 各组小鼠胃黏膜组织p65蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组小鼠胃黏膜组织p-p65蛋白表达水平高于正常组（P＜0.05）；蒲公英甾醇组小鼠胃黏膜组织p-p65蛋白表达水平明显低于模型组（P＜0.05）；iE-DAP组小鼠胃黏膜组织p-p65蛋白表达水平明显高于模型组（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠胃黏膜组织p-p65蛋白表达水平明显高于蒲公英甾醇组（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP组小鼠胃黏膜组p-p65蛋白表达水平明显低于iE-DAP组（P＜0.05）。（见表5、图2）

表5 各组小鼠胃黏膜组织p65、p-p65 蛋白表达水平比较（）

表5 各组小鼠胃黏膜组织p65、p-p65 蛋白表达水平比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与蒲公英甾醇组比较，cP＜0.05；与iE-DAP组比较，dP＜0.05

图2 各组小鼠胃黏膜组织p65、p-p65蛋白表达Western blotting图

3 讨 论

Hp是革兰氏阴性螺旋形细菌，据统计全球约44亿人感染Hp，尽管多数Hp阳性患者无明显症状，但感染易导致各种临床疾病的发生发展[11]。中医学认为Hp感染具有“湿热”邪气的相似特征，脾胃湿热环境有利于Hp的生长繁殖。西医治疗通常以四联疗法根除Hp为主，但易引起患者高耐药性、高复发率及肠道菌群紊乱等问题。中医药具有低毒、高效、副作用小、不易复发且不易产生耐药等优势，因此，中药用于多种疾病的治疗。本研究旨在探讨蒲公英甾醇对HAG的治疗效果。

蒲公英具有清热解毒、利尿通淋、消肿散结的功效。蒲公英包含多种有效成分，如菊苣酸、绿原酸、甾醇、倍半萜烯内酯和多糖等，具有抗肿瘤、抗氧化、抗补体及降血糖等生物学功效。其中，蒲公英甾醇是其主要有效活性成分之一，CHE L等[12]研究发现，蒲公英甾醇可以减轻溃疡性结肠炎小鼠结肠组织损伤，抑制炎症反应和细胞凋亡。ZHENG F等[13]研究表明，蒲公英甾醇可抑制NF-κB激活，降低血管炎症反应。JIANG S H等[14]研究显示，蒲公英甾醇可通过调节小鼠炎症反应，发挥对类风湿性关节炎的保护作用。本研究结果显示，经蒲公英甾醇干预后，小鼠一般情况好转，胃黏膜病理损伤程度减轻，血清IP-10、IFN-β水平降低，Hp定植减少，提示蒲公英甾醇可改善HAG小鼠脾胃湿热证症状，抑制炎症反应。

模式识别受体主要包括RIG-I样受体、Toll样受体、NOD样受体及胞浆病毒DNA受体。其中，NOD1是NOD样受体家族成员之一，在炎症细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞中高度表达，能识别G-肽聚糖衍生肽iE-DAP，通过半胱天冬酶活化募集结构域以ATP依赖的方式寡聚化并与RIP2相互作用[15]。NOD1/RIP2相互作用导致NF-κB激活，驱动趋化因子、促炎性细胞因子及Ⅰ型干扰素产生与释放[16]。JEON D等[17]研究表明，蒲公英提取物可以通过抑制NF-κB通路减轻LPS诱导的人脐静脉内皮细胞炎症变化。SANG R等[18]研究显示，蒲公英甾醇可通过抑制NF-κB炎症信号通路和抗凋亡信号通路预防伴刀豆球蛋白A诱导的小鼠急性肝炎损伤。本研究结果显示，蒲公英甾醇可下调HAG小鼠胃组织中NOD1 mRNA、RIP2 mRNA和p-p65蛋白表达，NOD1受体激动剂iE-DAP则呈相反的作用效果，iE-DAP和蒲公英甾醇同时处理后，iE-DAP对通路相关基因转录和蛋白表达的促进作用被逆转，提示蒲公英甾醇可通过调控NOD1/NF-κB通路改善HAG小鼠脾胃湿热证症状，抑制炎症反应。

综上所述，蒲公英甾醇可改善HAG小鼠脾胃湿热证症状，抑制炎症反应，作用机制可能与调控NOD1/NF-κB通路有关。