海藻酸盐/分离乳清蛋白/海藻糖复合保护剂提高益生菌活力探究

◎ 万 欣，周 勇，卢宗梅，邴狄祥，郭世堂，叶 震，何 珣，陈可泉

（1.南京工业大学生物与制药工程学院，江苏 南京 211816；2.中粮生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233000）

植物乳杆菌常被加工成益生菌剂，预防和治疗胃肠道疾病，如肠易激综合征、溃疡性结肠炎和腹泻病[1]。在益生菌剂的制备过程中，植物乳杆菌通常通过冷冻干燥被干燥成粉末，而冷冻干燥会花费大量的时间和精力。与冷冻干燥相比，喷雾干燥时间更短、能耗更低、成本更低，更适合工业化生产[2]。益生菌剂在喷雾干燥过程中，高温干燥脱水会降低益生菌的活力。高温会破坏蛋白质、核酸等大分子物质的结构，破坏单体单元之间的连接，最终导致单体单元的破坏。干脱水会改变细胞质膜的流动性和物理状态，导致代谢活动降低[3-4]。不利的环境条件，如酸、热、压力和氧气，也将导致益生菌的细胞活力显著下降[5]。保护剂在保护益生菌免受不利条件影响，以及干燥后长时间储存方面起着至关重要的作用[5]。乳清蛋白（WP）是奶酪生产过程中的副产品，占乳蛋白总量的20%，具有出色的胶凝和成膜特性[6]。植物乳杆菌用乳清蛋白和支链淀粉包埋，喷雾干燥获得的活菌数可以达到7.24 log CFU·g-1[7]。本文以海藻酸盐、分离乳清蛋白、海藻糖为保护剂，提高喷雾干燥后植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活菌数，优化保护剂配比和喷雾干燥参数。此外，在储存过程中评估了菌剂的最佳储存温度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013，由中粮生物科技股份有限公司提供；分离乳清蛋白，购自南京通盈生物科技有限公司；其他化学品，均为国药分析级试剂。

1.2 植物乳杆菌悬浮液的制备

植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013接种于MRS培养基中，37 ℃条件下培养18 h；通过在3 000 r·min-1条件下离心10 min、4 ℃收集细胞并用无菌氯化钠溶液0.85%（w/v）洗涤两次。通过将细胞重悬在氯化钠溶液中并在4 ℃下储存，获得细胞悬浮液。

1.3 保护剂的制备及喷雾干燥工艺

将海藻酸盐、分离乳清蛋白、海藻糖用蒸馏水溶解制备保护剂溶液，并优化配比。在室温下将保护剂与Lactobacillus plantarumCGMCC 15013悬浮液混合。混合溶液通过喷雾干燥器（SD-1500，Triowin，上海，中国）进行喷雾干燥。优化了Lactobacillus plantarumCGMCC 15013与保护剂的比例、进气温度和进料流速。最后，收集干燥的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013发酵剂。

1.4 保护剂配比优化

1.4.1 单因素测试

进行单因素检验主要是为了评估海藻酸盐、分离乳清蛋白、海藻糖对Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌数的影响，并确定它们适用于响应面法（RSM）的范围。在此过程中，Lactobacillus plantarumCGMCC 15013与保护剂的比例为1∶1（v∶v），进料流速为300 mL·h-1，进风温度为120 ℃。

1.4.2 Box-Behnken 实验设计

海藻酸盐（A）、分离乳清蛋白（B）、海藻糖（C）、蔗糖（D）的最佳范围是基于单因素测试确定的。基于3个水平的4个主要因素的Box-Behnken设计用于探索保护剂的最佳比例以及这些变量的相互作用。整个设计包括29个实验，3个重复。因子及水平见表1。实验设计、图形构建和结果分析由Design of Expert（DOE Version 8.5, StatEase. Inc, Minneapolis,MN. USA）进行。计算回归方程，分析等高线图和3D曲面图，得到各变量的最优值。

表1 Box-Behnken 实验设计参数表（单位：g·L-1）

1.5 喷雾干燥参数优化

1.5.1 单因素测试

进行单因素试验主要是为了评估细菌与保护剂的比例、进料流量，以及植物乳杆菌活菌数的入口空气温度，并确定其适合正交试验的范围。保护剂由25.3 g·L-1海藻酸盐、87.8 g·L-1分离乳清蛋白、15.9 g·L-1海藻糖和150.3 g·L-1蔗糖组成。

1.5.2 正交试验设计

在单因素试验的基础上，确定了细菌与保护剂的比例（A）、进料流速（B）和温度（C）的最佳范围。形成4因素3水平正交试验以优化喷雾干燥参数。表2显示了正交试验参数。每个处理一式3份进行。

表2 正交试验中的因素和水平表

1.6 发酵剂中植物乳杆菌的存活率

喷雾干燥前后植物乳杆菌的活菌数通过平板菌落计数法一式3份测定。将1.0 gLactobacillus plantarumCGMCC 15013溶解在9 mL柠檬酸三钠溶液（3%，w/v）中，将悬浮液用0.85%盐水溶液连续稀释10倍，并涂在MRS琼脂上。计数前将平板在37 ℃孵育48 h。

1.7 储存期间植物乳杆菌在发酵剂中的生存力

植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在-20 ℃、4 ℃和25 ℃下可保存120 d，计算植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活菌数。所有实验一式3份进行，结果表示为平均值±标准差。使用SPSS 16.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）来分析统计显著性。当p＜0.05时，假设有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 保护剂配比优化

保护剂比例采用Box-Behnken设计进行分析。在这项研究中，海藻酸盐（A）、分离乳清蛋白（B）、海藻糖（C）、蔗糖（D）的不同组合进行了29次，每个实验一式3份进行，结果如表3所示。通过软件分析得到基于实验因素的回归方程如下：

表3 保护剂的方差分析表（ANOVA）

模型的F值为31.70，p＜0.000 1，表明模型稳定且具有统计学意义。同样地，报告了A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2和D2。修正系数R2计算为0.938 8，通过实验参数及其相互作用来解释响应值的变异性，暗示该模型可以解释93.88%的变异。本实验得到的调整系数R2与相关系数R2的差异在逻辑上是可以接受的。因此，该模型适用于分析和预测保护剂的最佳配比。

2.2 响应曲面和等高线图

在研究中，使用海藻酸盐、分离乳清蛋白、海藻糖和蔗糖作为植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的喷雾干燥保护剂，并通过RSM优化它们的比例，见图1。

图1 响应曲面和等高线图

响应曲面图的曲线特性显示了变量和响应值之间的相互作用[8]。图1（a）中的椭圆形显示了海藻酸盐、分离乳清蛋白对提高植物乳杆菌细胞活力的显著影响。在低浓度下，活菌数随着海藻酸盐、分离乳清蛋白的加入而增加；图1（b）显示了海藻酸盐、海藻糖之间的显著相互作用；图1（c）中的椭圆形状显示了分离乳清蛋白和蔗糖在响应值方面的显著相互作用。随着分离乳清蛋白和蔗糖浓度的增加，植物乳杆菌的活菌数增加，还发现海藻糖和蔗糖之间的相互作用提高了菌活力，如图1（d）所示。分离乳清蛋白与海藻糖、海藻酸盐与蔗糖之间的相互作用分别如图1中（e）、（f）所示。

海藻糖具有稳定的功效和优异的加工性能，可在干燥过程中用作赋形剂以稳定蛋白质结构。海藻糖具有高玻璃化转变温度，可以通过形成玻璃结构来限制分子间的相互作用[8]。此外，海藻糖可以被作为益生元来提高微生物细胞对不利环境条件的适应性，提高微生物细胞存活率[9]。研究表明，海藻糖是一种极好的喷雾干燥保护剂。在喷雾干燥过程中，水分的流失会导致植物乳杆菌的活菌数显著减少。此外，研究表明蔗糖还可以防止环境对微生物细胞膜的不可逆损伤[10]。

2.3 最佳条件的确定和验证

根据RSM，海藻酸盐、分离乳清蛋白、海藻糖和 蔗 糖 分别为39.09 g·L-1、88.56 g·L-1、14.01 g·L-1和127.70 g·L-1，作为最佳喷雾干燥保护剂的最理想浓度，在这些预测条件下，植物乳杆菌的活菌率为75.68%。为了验证优化的工艺参数，基于建议的模型进行了3个验证实验，植物乳杆菌的活菌率为75.11%。3个试验的实验平均值与预测值非常吻合，它们的差异在可接受的范围内。本文较高的活菌率表明植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013受到海藻酸盐、分离乳清蛋白、海藻糖和蔗糖作为保护剂的有效保护。

2.4 喷雾干燥参数优化

设计微生物细胞与保护剂比例分别为2∶1、3∶1和4∶1（v∶v），进料流速分别为210 mL·h-1、240 mL·h-1和300 mL·h-1，进风温度分别为110 ℃、115 ℃和120 ℃，进行正交试验。正交试验用于优化喷雾干燥参数。通过正交L9(34)测试设计评估了3个因素，如表4所示。结果表明，这些因素对植物乳杆菌活菌数的影响程度依次为：温度（C）＞微生物细胞与保护剂的比例（A）＞进料流速（B）。由均值分析可知，理论最佳喷雾干燥植物乳杆菌活菌数的参数是细菌与保护剂的比例3∶1（v∶v），进料流速240 mL·h-1，进气温度115 ℃（A2B2C2）。植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活 菌 数 为9.24 log CFU·g-1（活 菌 率78.12%），含水量为4.33%。活菌数小于正交试验最佳参数A2B1C2的9.38 log CFU·g-1（活菌率79.28%），因此确定实际最佳喷雾干燥参数为细菌与保护剂的比例3∶1（v∶v），进料流量 200 mL·h-1，进风温度115 ℃。本研究中使用的保护剂比例和喷雾干燥工艺参数可以保护植物乳杆菌更好。

表4 正交试验的结果和分析表

2.5 植物乳杆菌储存期间的稳定性

微生物菌剂的储存期主要由储存温度决定。在低温下，微生物细胞更易于保持活性。本研究中，植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在-20 ℃、4 ℃和25 ℃的贮藏条件下，活菌数随时间延长而下降，见图2。不同的储存温度之间存在显著差异。植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在25 ℃贮藏时，生存力受到最严重的损害。植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在25 ℃下90 d后完全丧失生存力。在-20 ℃和4 ℃下保存120 d后，活菌数分别为8.38 log CFU·g-1和6.66 log CFU·g-1，-20 ℃为植物乳杆菌菌剂的最适保存温度。

图2 植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CGMCC 15013在储存期间的活菌数量变化图

3 结论

植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的最佳保护剂配比为39.09 g·L-1海藻酸盐、88.56 g·L-1分离乳清蛋白、14.01 g·L-1海藻糖和127.70 g·L-1蔗糖。植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013菌剂的最佳喷雾干燥参数为细菌与保护剂的比例3∶1（v∶v），进料流速200 mL·h-1，进风温度115 ℃，植物乳杆菌最大活菌数9.38 log（CFU·g-1），活菌率79.28%。植物乳杆菌发酵剂在-20 ℃下储存120 d后，发酵剂中植物乳杆菌的活菌数为8.38 log CFU·g-1。本研究为喷雾干燥贮藏后的植物乳杆菌提供了一种新的保护剂配方，具有很好的保护作用。该保护剂对益生菌剂生产具有重要意义。