短管兔耳草多糖的结构表征及其免疫调节活性研究

余蕊宏，孟 祯，孙梦珂，陈仕雄，张浚文，黄一帆，秦 韬，任 喆

(福建农林大学动物科学学院 福建省兽医中药与动物保健重点实验室，福州 350002)

短管兔耳草(LagotisbrevitubaMaxim)又名“洪连”，属玄参科(Scrophulariaceae)短管兔耳草属(LagotisGaertn)草本植物[1]，主要分布于我国西藏、青海、甘肃等[2]地区。作为民间传统藏药，短管兔耳草在治疗全身发热、肺病、肾炎、高血压等[3]疾病中具有良好的疗效。大量药理研究和临床实践表明，短管兔耳草主要含有苯丙素苷类、酚类、环烯迷萜苷类和黄酮类等化学成分，这些成分具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、免疫调节等[4-6]作用。多糖(polysaccharide)作为短管兔耳草中的活性成分之一，是一类具有多种生物活性的天然大分子物质，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节活性等[7-9]。多糖作为一种天然的免疫调节剂，具有毒副作用小、安全性较高等[10]特点，已成为近年来研究的一大热点。

树突状细胞(dendritic cells，DC)是一种重要的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)，在机体细胞免疫和体液免疫调控中具有重要作用[11]。未成熟的DC受到抗原刺激后变为成熟的DC，迁移至淋巴器官后，通过主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)分子提呈抗原多肽和共刺激分子来激活T细胞，从而启动特异性免疫应答[12-13]。研究表明[14]，多糖可通过与DC表面的多种受体结合，激活不同的信号通路，从而诱导DC表型和功能的成熟，最终对机体起到免疫调节作用。目前，国内外关于短管兔耳草的报道只局限于其化学组成和提取工艺方面[15-17]，尚未见有关短管兔耳草多糖(LagotisbrevitubaMaxim polysaccharide，LMP)的结构和免疫调节活性的报道。

因此，本试验从短管兔耳草中分离纯化得到成分均一的多糖LMP，通过高效凝胶色谱法(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)、傅里叶变换-红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)、紫外光谱(ultraviolet spectroscopy)、扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)、原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)等方法对其结构进行分析，并进一步评价其对BMDCs的免疫调节活性，以期为短管兔耳草多糖的开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

ICR雄性小鼠，6～8周龄，购于福州吴氏动物公司；短管兔耳草购自福州晴百旺公司；DEAE-52纤维素购于Whatman公司；蛋白含量检测试剂盒购自江苏凯基生物公司；RPMI 1640培养液、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；PBS、噻唑蓝(MTT)、红细胞裂解液、青霉素-链霉素购于Solarbio公司；anti-mouse CD16/CD32封闭抗体购自杭州联科生物公司；流式抗体anti-mouse FITC-CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ均购自eBioscience公司；丝裂霉素C购自合肥博美生物科技公司；脂多糖(LPS)、FITC-dextran购自Sigma公司；rm GM-CSF与rm IL-4均购自深圳欣博盛生物科技公司；小鼠TNF-α、IL-12试剂盒购自上海酶联生物科技公司；其余试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂公司。

1.2 主要仪器

ABT 320-4M电子天平系德国科恩公司产品；真空冷冻干燥机购自德国CHRiST公司；傅里叶红外光谱仪系美国Thermo公司产品；RE-52CS旋转蒸发仪系上海亚荣生化仪器厂产品；Nano Plus3激光粒度仪购自Malvern公司；MultiMode 8 SPM原子力显微镜系Bruker公司产品；台式高速离心机购自美国BECKMAN公司；NovoCyte流式细胞仪购自艾森生物有限公司；Infinite M200 Pro酶标仪购自TECAN公司；二氧化碳恒温培养箱购自西德Haraneus公司。

1.3 短管兔耳草多糖的分离和纯化

1.3.1 短管兔耳草多糖的提取 称取干燥的短管兔耳草500 g，置于3倍体积的95%乙醇中浸煮3 h，用以除去脂溶性物质。脱脂后的短管兔耳草按1∶20的固液比加入双蒸水，置于恒温电热套(110 ℃)中浸煮2 h。8 000 r·min-1离心10 min后，合并所有的上清液，经减压浓缩至原体积的1/3，再次加入95%乙醇进行醇沉，静置过夜。8 000 r·min-1离心10 min 后，收集沉淀，经冷冻干燥后得到短管兔耳草粗多糖。

1.3.2 除蛋白 采用Sevage液(正丁醇∶氯仿=1∶5)除去短管兔耳草粗多糖的蛋白，Sevage液与粗多糖溶液的比例为1∶5。重复上述步骤3～4次 后，合并所有的上清液，经浓缩、醇沉、离心后，收集沉淀，经冷冻干燥后得到除蛋白后的短管兔耳草粗多糖。

1.3.3 DEAE-52纤维素柱层析 采用DEAE-52纤维素柱层析法对短管兔耳草粗多糖进一步分离纯化，上样浓度为100 mg·mL-1，上样体积为10 mL，流速为1 mL·min-1，洗脱液为双蒸水。利用自动收集器收集洗脱液，每管收集5 min，并以苯酚-硫酸法测定每管洗脱液在490 nm处的吸光值，以管数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制洗脱曲线图。分别合并收集含多糖的洗脱液，减压浓缩后静水透析24 h(分子截留量为100～500 u)，期间每12 h 换水1次。将透析后的溶液进行浓缩，冷冻干燥后即得短管兔耳草多糖(LMP)。

1.3.4 短管兔耳草的化学组成测定 采用苯酚-硫酸法在490 nm处测定LMP的糖含量，采用考马斯亮蓝法在595 nm处测定LMP的蛋白含量，采用鲎试剂法在545 nm处检测LMP中的内毒素含量。

1.4 短管兔耳草多糖的结构分析

1.4.1 平均分子量测定 将浓度为1 mg·mL-1的LMP溶液，采用HPGPC测定其平均分子量。色谱条件：检测器为安捷伦1260 Infinity液相色谱仪，配RID-1A示差折光检测器；色谱柱选用KS-805、KS-804和KS-802三根串联；流动相为双蒸水；流速为1 mL·min-1；柱温为70 ℃，检测器温度为50 ℃。

1.4.2 红外光谱分析 精密称取2 mg LMP，与200 mg KBr粉末混匀后，于玛瑙研钵中研磨成极细粉末，压片后用傅里叶红外光谱仪在4 000～500 cm-1进行扫描，并记录红外光谱。

1.4.3 紫外光谱分析 将LMP配制成0.5 mg·mL-1的多糖溶液，使用紫外分光光度计在200～800 nm测定多糖溶液的紫外吸收光谱。

1.4.4 粒径和Zeta电位 采用激光粒度仪测定LMP的平均粒径与Zeta电位，样品的浓度为0.1 mg·mL-1，测定温度为25 ℃。

1.4.5 扫描电镜分析 将少量LMP粉末均匀涂抹于导电胶表面，经喷金处理后，通过扫描电镜对LMP的微观结构进行观察。

1.4.6 原子力电镜分析 配制10 μg·mL-1的LMP溶液，经磁力搅拌1 h后，用滴管滴加1滴在云母表面，待其干燥后用原子力电镜在Tapping模式下成像，并对其形态和空间结构进行观察。

1.5 短管兔耳草多糖的体外免疫活性分析

1.5.1 小鼠骨髓源树突状细胞的体外诱导培养 取6～8周龄的ICR雄性小鼠，以颈椎脱臼法处死后，置于装有75%酒精的容器中。无菌取出股骨和胫骨，用纱布去除附着的肌肉和结缔组织后，剪掉骨的两端，用1 mL无菌注射器吸取PBS，反复冲洗骨髓腔，直到骨髓腔发白。收集细胞悬液，1 500 r·min-1离心10 min后弃上清。收集细胞沉淀，按1∶5体积加入红细胞裂解液，于冰上裂解2 min。加入RPMI 1640基础培养液终止反应，1 500 r·min-1离心10 min，弃上清。收集细胞沉淀，加入含20 ng·mL-1rm IL-4和20 ng·mL-1rm GM-CSF的RPMI 1640完全培养液(含10% FBS和1%青-链霉素)，将细胞浓度调整为1×106cell·mL-1后接种于6孔板中，每孔4 mL，于37 ℃、5%CO2条件下培养6 d，隔天半量换液并补充刺激因子，培养期间用倒置显微镜观察细胞的形态变化。第7天，弃上清后获得BMDCs，用RPMI 1640完全培养液重悬，用于后续试验。

1.5.2 细胞增殖活性 采用MTT法检测LMP对BMDCs的增殖活性。将培养至第7天的BMDCs，用RPMI 1640完全培养液调整细胞的浓度为1×105cell·mL-1，加入96孔板中，每孔100 μL。37 ℃，5% CO2环境下培养24 h后，每孔加入100 μL 含LMP的RPMI 1640完全培养液(终浓度分别为0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μg·mL-1)，另设空白对照组。24 h后，每孔加入10 μL MTT(5 mg·mL-1)，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后，将96孔板于酶标仪570 nm处测定吸光度值，并以空白组的细胞活力为100%来分析各组的细胞活力。

1.5.3 试验分组 根据“1.5.2”中BMDCs增殖的试验结果，分为4组：Control组(RPMI 1640)、LPS组(1 μg·mL-1LPS)、LMP组(终浓度分别为3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1)，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2中培养24 h后用于后续试验。

1.5.4 细胞表面分子表达 BMDCs按“1.5.3”分组培养24 h后，弃上清，用预冷的PBS洗两遍，每孔各加入1 μL CD16/CD32封闭抗体封闭，冰浴10 min 后，分别加入FITC-CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ，4 ℃避光孵育30 min后，PBS清洗两遍，弃上清，用500 μL PBS重悬后，用NovoCyte流式细胞仪检测。

1.5.5 细胞吞噬活性 BMDCs按“1.5.3”分组培养24 h后，弃上清，用预冷的PBS洗两遍，加入丝裂霉素C(2 mg·mL-1)作用30 或90 min。PBS清洗两次后，每孔各加入100 μL FITC-dextran(1 mg·mL-1)，4或37 ℃条件下避光染色1 h后，PBS清洗两遍，弃上清，用500 μL PBS重悬后，用NovoCyte流式细胞仪检测各个条件下的平均荧光强度(MFI)，并按下式计算细胞吞噬率。

ΔMFI(%)=MFI(37 ℃)-MFI(4 ℃)。

1.6 统计分析

2 结 果

2.1 短管兔耳草多糖的制备

由图1A可知，经DEAE-52纤维素柱层析分离纯化得到的洗脱曲线为单一峰，表明组分均一，主要分布在20～60管，因此短管兔耳草多糖的DEAE-52 纤维素色谱柱出峰时间在100～300 min。收集100～300 min内的洗脱液，经冷冻干燥后得到白色粉末状的短管兔耳草多糖，命名为LMP。经测定，LMP的得率(18.5±1.7)%，糖含量(89.7±1.9)%，蛋白含量为(0.8±0.1)%，内毒素含量为0.011 7 EU·mL-1。

2.2 短管兔耳草多糖的结构分析

2.2.1 平均分子量 如图1B所示，LMP在凝胶色谱柱上展现出来为单一对称峰，峰型较宽，表明LMP的平均分子量分布较为均一。结合葡聚糖的标准曲线y=53.926 13-8.289 42x+0.529 17x2-0.015 43x3+0.000 17x4，将LMP在色谱柱的保留时间带入标准曲线中，得到LMP的平均分子量为3.18×103u。

2.2.2 红外光谱 如图1C所示，LMP在3 285.14 cm-1处的吸收峰型较宽，是由O-H的伸缩振动引起，在2 930.31 cm-1和1 398.14 cm-1处的吸收峰分别代表C-H的伸缩振动和变角振动特征吸收峰，这三种吸收峰均属于多糖的典型特征峰，表明LMP属于多糖类物质。在1 641.13 cm-1处有一吸收峰，代表多糖官能团中O-H键的伸缩振动。在1 200～1 000 cm-1的吸收峰代分别代表C-O-C 和C-O-H的伸缩振动，933.49 cm-1处的吸收峰是由呋喃环伸缩振动引起的，在823.46 cm-1的吸收峰显示其含有β-构型的糖苷键。

A.LMP在DEAE-52纤维素层析柱洗脱曲线；B.LMP在凝胶色谱柱上的平均分子量分布图；C.LMP的红外光谱图; D.LMP的紫外光谱图

2.2.3 紫外光谱扫描 LMP在200～800 nm的紫外扫描图如1D所示，LMP在260 和280 nm处没有明显的吸收峰，表明LMP不含核酸和蛋白质。

2.2.4 粒径与Zeta电位 由图2A可知，当LMP浓度为0.1 mg·mL-1时，平均粒径为1 483.89 nm。由图2B可知，当LMP浓度为0.1 mg·mL-1时，溶液带负电荷，电位值为-14.81 mV。

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A.粒径; B.Zeta电位

2.2.5 扫描电镜和原子力显微镜 图3A为LMP的扫描电镜图，结果表明，在2 200的放大倍数下，样品的表面形貌光滑，结构较为规整，呈片状且棱角分明。图3B为LMP的原子力显微镜图像，扫描范围为2.00 μm×2.00 μm，可看出LMP分布较均匀，其单链高度5.4 nm左右。

A.扫描电镜图；B.原子力电镜图

2.3 短管兔耳草多糖对BMDCs的免疫调节作用

2.3.1 BMDCs的形态学观察 倒置显微镜下BMDCs的细胞形态变化如图4所示，第1天，细胞的体积较小，呈圆形。第7天，细胞的体积变大，形态变为纤长的树枝样，具有较多突起，符合典型成熟DC的细胞形态。

图4 倒置显微镜观察BMDCs的细胞形态(200×)

2.3.2 短管兔耳草多糖对BMDCs增殖活性的影响 LMP对BMDCs增殖活性的影响如图5所示，与空白组相比，0.78～100.00 μg·mL-1LMP能显著促进BMDCs增殖(P<0.05)，以25.00 μg·mL-1LMP的增殖效果最强。当LMP的浓度为200.00～800.00 μg·mL-1时，LMP呈现一定的细胞毒性作用。因此，选择3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-15个浓度用于后续的细胞活性评价。

小写字母相同的表示差异不显著(P>0.05)，不同的表示差异显著(P<0.05)。下图同

2.3.3 短管兔耳草多糖对BMDCs表面分子表达的影响 将不同浓度的LMP(3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1)作用BMDCs 24 h后，细胞表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达情况如图6所示。3.13～50.00 μg·mL-1LMP的CD80表达率均显著高于空白组(P<0.05)，且呈剂量依赖性。当LMP的浓度为12.50、25.00 μg·mL-1时，CD80的表达率与LPS组相比差异不显著(P>0.05)，3.13～6.25 μg·mL-1LMP的CD80表达率均显著低于LPS组(P<0.05)。LMP在浓度为3.13～25.00 μg·mL-1时，CD86的表达率均显著高于空白组(P<0.05)，以12.50 μg·mL-1LMP的CD86的表达率最高，为58.4%。3.13～50.00 μg·mL-1LMP的MHC-Ⅰ的表达率均显著高于空白组(P<0.05)，且呈剂量依赖性。当LMP的浓度为12.50～50.00 μg·mL-1时，MHC-Ⅰ的表达率与LPS组相比差异不显著(P>0.05)，3.13、6.25 μg·mL-1LMP的MHC-Ⅰ 表达率显著低于LPS组(P<0.05)。12.50～50.00 μg·mL-1LMP MHC-Ⅱ的表达率均显著高于空白组(P<0.05)，且呈剂量依赖性增长，以50.00 μg·mL-1LMP的MHC-Ⅱ表达率最高，为54.3%。

图6 LMP对BMDCs表达CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的影响

2.3.4 短管兔耳草多糖对BMDCs吞噬功能的影响 由图7可知，与FITC-dextran作用30 或90 min 后，LPS组和LMP组的吞噬率均显著低于空白组(P<0.05)。与FITC-dextran作用30 min后，随着LMP浓度的增加，吞噬率呈剂量依赖性降低。当LMP浓度为6.25、12.5 μg·mL-1时，吞噬率与LPS组相比差异不显著(P>0.05)。当LMP浓度为25、50 μg·mL-1时，吞噬率显著低于LPS组(P<0.05)，以50 μg·mL-1LMP的吞噬率最低，为6.1%。与FITC-dextran作用90 min后，3.13、6.25、12.50、50.00 μg·mL-1LMP的吞噬率均显著高于LPS组(P<0.05)，而25.00 μg·mL-1LMP的吞噬率与LPS组相比差异不显著(P>0.05)，吞噬率为10.1%。相比之下，与FITC-dextran作用30 min的吞噬率(6.1%)显著低于作用90 min的吞噬率(10.1%)(P<0.05)。

图7 LMP对BMDCs吞噬功能的影响

2.3.5 短管兔耳草多糖对BMDCs分泌TNF-α和IL-12的影响 LMP对BMDCs分泌细胞因子TNF-α和IL-12的影响如图8所示。由图8A所示，与空白组相比，3.13～50.00 μg·mL-1LMP可增加细胞因子TNF-α的分泌，以6.25 μg·mL-1LMP的TNF-α含量最高。由图8B所示，与空白组相比，3.13～50.00 μg·mL-1LMP可显著增加细胞因子IL-12的分泌(P<0.05)，以6.25 μg·mL-1LMP的IL-12含量最高。

图8 LMP对BMDCs分泌TNF-α(A)和IL-12(B)的影响

3 讨 论

藏药短管兔耳草作为藏药的常用药材[18]，已有悠久的历史。多糖是短管兔耳草的有效活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、免疫调节等[19-20]作用。研究表明[21]，多糖的生物活性与其结构和构像密切相关，如糖苷键的类型、分子量、空间构型等。不同的多糖具有不同的结构，其生物活性也具有较大差异，因此研究多糖的构效关系显得尤为重要。

本试验通过水提醇沉法从短管兔耳草中提取到LMP，经DEAE-52纤维素柱层析洗脱得到的洗脱曲线为单一峰，说明LMP的组分较为均一。理化性质结果显示LMP的得率为(18.5±1.7)%，糖含量为(89.7±1.9)%，蛋白含量为(0.8±0.1)%，内毒素含量为0.011 7 EU·mL-1，说明LMP的糖含量较高、蛋白含量较低且无内毒素污染[22]，且UV光谱图显示在260～280 nm处未检测到吸收峰，表明LMP不含核酸和蛋白质，这与蛋白含量测定结果一致，因此可用于后续研究。多糖分子量的大小是影响其生物活性的主要因素之一[23]，高分子量多糖因结构不均一导致活性不高，而低分子量的多糖因分子质量分布范围小，往往表现出更高的生物活性[24]。HPGPC结果显示,LMP的平均分子量为3.18×103u，属于低分子量多糖，表明LMP可能具有提高生物活性的效果，这与Chandrashekar等[25]的研究结果一致。红外谱图显示，LMP在多糖的特征吸收峰(3 700～3 000 cm-1和3 000～2 800 cm-1)处均有吸收峰，表明LMP属于多糖类物质。在933.49和823.46 cm-1两处的吸收峰分别代表是呋喃环的伸缩振动和β-构型的糖苷键，一般认为β构型的多糖具有较高的活性[26]，说明LMP可能具有较高的生物活性，这与Yan等[27]的研究结果一致。

粒径的分布是反映多糖在水溶液中相互作用的重要指标之一，通常认为粒径越小越能被机体吸收利用，从而更好地发挥药理活性[28]。当LMP浓度为0.1 mg·mL-1时，平均粒径较大，为1 483.89 nm，这可能与多糖的浓度有关。Zeta电位能够通过粒子间静电排斥作用影响粒子在分散液中的稳定性，电位的绝对值越高表明分散粒子越稳定，体系更趋于稳定[29]。LMP的Zeta电位为-14.81 mV，表明体系较为稳定。SEM和AFM用于观察多糖的表面形貌，SEM结果显示，LMP的表面光滑，呈片状，棱角分明，AFM结果显示，其单链的高度为5.4 nm左右。多糖分子单链直径在0.1～1.0 nm[30]，而LMP的高度远大于单链分子的估算值，这可能是多糖的主链为若干股形成或与探针的增宽效应有关。这与Li等[31]的研究结果一致。

DC是专职的APC，能够摄取、加工处理抗原，并将处理过的抗原递呈给T、B淋巴细胞，从而启动免疫反应[32]。本试验采用MTT法对BMDCs增殖活性进行了考察，3.13～50.00 μg·mL-1LMP能显著促进BMDCs增殖，表明3.13～50.00 μg·mL-1的LMP对BMDCs来说是一个安全的剂量范围，因此选择3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-15个浓度用于后续试验。

未成熟的DC低表达共刺激因子(如CD80、CD86、CD83)，但具有较强的摄取和吞噬抗原能力，成熟的DC则相反[33-34]。研究表明[35]，最能反映DC免疫功能的是MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86的表达水平，它们是成熟DC的标志性分子，能识别、摄取抗原以及与它免疫细胞间信号传递的必要条件。在本试验中，与空白组相比，LMP在3.13～50.00 μg·mL-1浓度均可上调CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达，且呈剂量依赖性，表明LMP可以促进BMDCs表型的成熟，以25.00 μg·mL-1LMP促进细胞表面分子(CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)表达的效果最好。吞噬活性结果发现，经LMP刺激后的BMDCs，吞噬率显著低于空白组(P<0.05)。BMDCs与FITC-dextran作用30 min后，LMP在浓度为25.00、50.00 μg·mL-1时，降低BMDCs吞噬抗原的能力强于其他浓度组；与FITC-dextran作用90 min后，LMP在浓度为25.00 μg·mL-1时，降低BMDCs吞噬抗原的能力强于其他浓度组。因此，以25.00 μg·mL-1LMP吞噬FITC-dextran的效果最好，并以30 min的细胞吞噬率最低。

IL-12是由活化的DC、中性粒细胞和巨噬细胞产生，具有参与细胞免疫的作用[36]。IL-12和TNF-α可刺激T细胞的生长和功能的成熟，从而促进细胞免疫[37]。本研究发现，与空白组相比，3.13～50.00 μg·mL-1LMP能促进BMDCs分泌TNF-α和IL-12，说明LMP能上调BMDCs因子TNF-α和IL-12的分泌，促进BMDCs的成熟。

4 结 论

从短管兔耳草中提取得到的LMP，是一种含β-构型糖苷键的小分子量多糖，平均分子量为3.18×103u。该多糖能显著促进BMDCs细胞表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达，提高细胞因子TNF-α和IL-12的含量，还能降低细胞吞噬活性，表明LMP的免疫调节效果显著。本研究可为短管兔耳草的开发及利用提供一定的理论基础。