穿心莲内酯干混悬剂对人工感染大肠杆菌致肉鸡腹泻的药效评价

2021-11-24李江北傅嘉莉李美娣陈建新

畜牧兽医学报 2021年11期

李江北，杨霞，傅嘉莉，李美娣，邱电，陈建新，武力

(华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室，广州 510642)

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种常见的多发性传染病[1]，可发生于各日龄鸡群，该病严重影响鸡的成活率及生长性能，已成为制约我国养鸡业健康发展的重要疫病[2]。大肠杆菌性腹泻是鸡大肠杆菌病的其中一种类型，是肠毒素性大肠杆菌ETEC入侵机体后，在小肠中定殖并释放出肠毒素，从而引起严重的腹泻[3]，发病鸡只还表现精神沉郁、食欲减退或废绝[4]、体温升高、体重下降等症状[5]。该病发病率高达 29%～71%，病死率可达 4%～42%[6]。由于多年来抗生素在鸡养殖业上的长期、广泛使用，使得细菌耐药性问题日益严重[7]，现有抗生素难以有效防控该疾病，抗生素替代物的开发已逐渐成为鸡养殖业的迫切需求和研究热点[8]。临床实践表明，穿心莲及复方制剂对腹泻有较好的防治效果，并具有低残留、低毒性、不易产生耐药性等优点[9]。曹雨辰等[10]发现，以苦参和穿心莲为主要药材制备的“参莲口服液”对临床生长猪和肉鸡的腹泻具有显著疗效；严永武等[11-12]报道，穿心莲末灌服对绵羊腹泻具有显著疗效；Li等[13]研究表明，莲香散能降低大肠杆菌感染肉鸡的死亡率，改善肉鸡生长性能。但由于穿心莲质量容易因产地、气候、耕作条件及加工方式的不同而发生变化，从而影响穿心莲提取物及复方的质量和药效的稳定性[14-15]。以穿心莲活性成分为原料的兽药制剂具有有效成分确切可控，疗效稳定等优点，因而比穿心莲及其复方具有更好的应用前景[16]。

穿心莲内酯是清热解毒类中药穿心莲的主要有效成分[17]，具有免疫调节、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降糖、降压等药理活性[18]，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及细菌性痢疾有显著疗效，被誉为“天然抗生素药物”[19]。张程亮等[20]研究发现，穿心莲内酯可改善由泻叶和蓖麻油导致的小鼠腹泻；Guo等[21]报道，穿心莲内酯可通过干扰细菌群体感应降低禽致病性大肠杆菌及其毒素对鸡Ⅱ型肺细胞的损伤。但穿心莲内酯对鸡大肠杆菌腹泻的治疗未见报道。人医上，穿心莲内酯有滴丸、分散片、软胶囊等制剂[22]，但兽医上只批准穿心莲内酯作为原料药，尚没有任何兽用制剂获得批准，阻碍了该药的临床应用[23]。本试验依据穿心莲内酯的理化性质研制出穿心莲内酯干混悬剂，评价该干混悬剂对肉鸡大肠杆菌感染的临床药效，为穿心莲内酯抗肉鸡大肠杆菌感染的临床使用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要药品与试剂穿心莲内酯购于四川恒瑞通达生物科技有限公司，尿素购于福晨(天津)化学试剂有限公司，变性淀粉购于安徽华明太合生物工程有限公司，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠(CL-611)购于杜邦营养与生物科技，LB琼脂和肉汤购于广东凯微生物科技有限公司，粘菌素由清远容大生物工程有限公司赠送，血清生化试剂盒购于迈瑞生物医疗电子有限公司，丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.1.2 试验菌株产肠毒素性大肠杆菌ETECO101，由华南农业大学兽医学院药理教研室曾振灵教授课题组赠送。

1.1.3 试验动物 1日龄岭南黄快长型商品代肉鸡，由温氏大华农生物科技有限公司提供。

1.1.4 饲养管理试验在华南农业大学兽医学院的试验鸡舍内进行，试验鸡采用笼养方式。试验开始前1周对鸡舍进行全面清扫消毒。试验初始温度保持在33 ℃，随后每周降2～3 ℃，最后维持在24～26 ℃；相对湿度保持在65%～75%。试验期间鸡自由采食及饮水，给药期间确保药水饮完后再自由饮水。按照常规程序免疫，定期进行消毒，人工定时清粪，保持鸡舍环境卫生，每日观察和记录鸡群健康状况、死亡情况，及时清除死亡鸡只。

1.2 试验方法

1.2.1 穿心莲内酯干混悬剂的制备称取13 g尿素置于烧杯中，加入200 mL水搅拌至溶解，然后加入13 g变性淀粉搅拌至溶解，再加入4 g微晶纤维素-羧甲基纤维素钠(CL-611)，高速剪切机以12 000 r·min-1转速乳化10 min。称取10 g穿心莲内酯原料药加入溶液中搅拌至均匀分散，高速剪切机以12 000 r·min-1转速乳化10 min。所得含药混悬液在高压均质机低压200～300 bar下循环5次，依次逐渐加压至400、600、800和1 000 bar的压力下各循环5次，然后以压力1 200 bar循环20次，制得穿心莲内酯混悬液。以300 mL穿心莲内酯混悬液为基量，出风温度100 ℃，进风温度180 ℃和进料速度14 mL·min-1进行喷雾干燥，得到穿心莲内酯干混悬剂。

1.2.2 菌种制备取-70 ℃冷冻储存的受试细菌ETECO101接种于LB平板，并于 37 ℃恒温培养箱中培养过夜，使其长出合适大小的单菌落；挑取单菌落菌株接种于锥形瓶内100 mL LB肉汤中，置于 37 ℃、210 r·min-1转速的摇床中振荡培养12 h，使细菌生长至对数期，4 ℃预冷离心机内1 500 ×g离心8 min，弃掉上清液，然后用生理盐水重悬稀释，使菌液最终含菌量大约为 5 × 108cfu·mL-1，备用。

1.2.3 动物分组与试验设计将1日龄岭南黄快长型商品代肉鸡饲养至12日龄，选取健康试验鸡300只，随机分为5个组，每组4个重复，每个重复15只。第1组为空白对照组(CON组)，第2组为大肠杆菌攻毒组(ETECO101组)，第3、4、5组均为大肠杆菌攻毒加受试药物组。分别在第3、4试验组鸡的饮水中添加穿心莲内酯干混悬剂(AG)，使得饮水中药物浓度分别为100和200 mg·L-1，在第5组试验组鸡的饮水中添加粘菌素(colistin, CS)，药物浓度为60 mg·L-1。提前3 d连续给药直至攻菌后第3天停止给药，早、晚各给药1次，每次每个重复700 mL。于肉鸡15日龄攻毒，除空白对照组外，各组腹腔注射0.2 mL含5×108cfu·mL-1ETECO101的生理盐水，空白对照组腹腔注射0.2 mL 生理盐水。其中，每组3个重复(3×15只，以每个重复为单位)用于计算存活率、粪便评分、平均日增重和平均日采食量，以评价药物的药效，试验至感染后第7天结束；每组剩余的1个重复(15只)于攻菌后24 h和第5天分别取6只鸡进行采血、剖检和组织取样。具体分组及处理见表1。

表1 动物分组与试验设计表

1.3 样品采集及指标测定

1.3.1 存活率及生长性能在ETECO101感染后以每个重复为单位每天记录死亡率、体重和采食量，通过平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)计算饲料/增重比(FCR)。

1.3.2 腹泻在ETECO101感染后24和36 h，通过观察粪便形态，判定腹泻评分，分为4个等级(表2)：0-正常，无拉稀，粪便正常，形状规则；1-轻微，粪便周围有一圈拉稀，形状规则；2-中等，拉稀，粪便水样，形状无规则；3-严重，拉稀严重，粪便水样喷射状，带血丝，形状无规则。并根据评分系统，由与试验无关人员进行盲评，通过粪便得分进行腹泻判定。

表2 肉鸡腹泻评分标准

1.3.3 血清及组织样本采集在细菌感染后24 h 和第5天，每组的第4个重复中随机选取6只肉鸡，通过翼静脉穿刺收集血液样本，收集到真空采血管(5 mL)中，静置30 min，然后将血样在3 000×g4 ℃下离心15 min以收集血清，并在-80 ℃下储存以备分析。处死后取空肠用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，并固定在4%多聚甲醛中以进行组织学分析。脾和法氏囊组织称重，并将肝固定在4%多聚甲醛中以进行组织学分析。

1.3.4 免疫器官指数通过称量所采脾和法氏囊的重量，计算出各个器官的免疫指数，计算公式如下:

1.3.5 肠道形态将小肠组织置于4%的多聚甲醛溶液中固定2 d后，用石蜡包埋，然后用切片机切成厚度为5～10 μm的圆形切片，将切片用苏木精和曙红染色以观察肠道形态。测量每个样品5个定向良好的隐窝-绒毛单位的绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度与隐窝深度之比。

1.3.6 血清生化指标采用全自动生化分析仪测定血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素(UREA)、葡萄糖(GLU)和肌酐(CREA)含量。

1.3.7 血清氧化应激状态使用酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清中丙二醛(MDA)的含量，测定超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。

1.4 数据统计分析

采用GraphPad Prism 8中的方差分析(ANOVA)对数据进行显著性分析，然后采用T test比较对照组与所有其他组。结果以“平均值±标准误”表示，P<0.05表示具有显著差异。

2 结果

2.1 临床特征与死亡情况

ETECO101感染后，与正常组相比，发病鸡精神沉郁，羽毛杂乱，严重者静卧嗜睡、抱团，腹泻严重，肛门四周有粪便玷污，拉黄绿色稀粪，呈喷射状，不规则。与感染组相比，各给药组临床症状相对较轻。

ETECO101感染后12～24 h，肉鸡出现死亡(图1)，24 h后死亡明显减少。细菌感染后第7天，ETECO101组的存活率为68.9%，100 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组与粘菌素组的存活率为82.2%，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组的存活率为86.7%。相对于ETECO101组，100 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组与粘菌素组使肉鸡存活率提高13.3%(P<0.05)，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组使肉鸡存活率提高17.8%(P<0.05)。

*表示与感染组相比差异显著，P<0.05。下同

2.2 穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡生长性能的影响

从生长性能来看(表3)，攻毒后7 d内，相对于ETECO101组，各给药组均显著增加了肉鸡ADG(P<0.01)和ADFI(P<0.01)。

表3 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡生长性能的影响(n=3)

2.3 穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡腹泻的影响

从粪便评分来看(图2)，相对于空白组，ETECO101感染后的24和36 h，肉鸡腹泻显著升高；相对于ETECO101组，在24和36 h，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著抑制了肉鸡腹泻(P<0.05)；在36 h时，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂和粘菌素组显著抑制了肉鸡腹泻(P<0.05)。

腹泻评分基于每组3个重复进行打分

2.4 病理剖检与肝组织病理学

病理剖检发现，与正常组相比，感染组肉鸡腹腔腥臭味，充满黄绿色水样或黏稠液体。肝肿大，淤血或散在出血，表面覆有纤维素性黄色薄膜；心肿大，心包炎；脾肿大，充血；肠道胀气，肠壁变薄，肠黏膜脱落严重，有大量的出血点。与感染组相比，给药组症状相对较轻。

对肝组织进行组织病理学分析，结果表明(图3)，对照组肝细胞形态正常，肝索结构清晰，肝细胞呈多边形，细胞核仁明显；大肠杆菌攻毒组肝细胞排列紊乱，细胞之间界限不清，肝索结构消失，部分区域可见均质粉染，细胞发生碎裂的坏死灶；穿心莲内酯组和粘菌素组肝细胞形态较细菌攻毒组改善。

图3 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡第5天后肝组织病理变化的影响(400×)

2.5 穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡免疫器官指数的影响

从免疫器官指数来看(图4)，相对于空白组，ETECO101组显著降低了感染后24 h肉鸡法氏囊指数(P<0.01)，但第5天差异不显著；相对于ETECO101组，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著增加了感染后24 h肉鸡脾脏指数(P<0.01)；相对于ETECO101组，各给药组均显著增加了感染后24 h肉鸡法氏囊指数(P<0.01)。

图4 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡免疫器官指数的影响(n=6)

2.6 穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡血清生化指标的影响

采用全自动生化分析仪测定血清TP、ALB、GLB、UREA、GLU和CREA含量，结果见表4。从血清生化分析来看，相对于空白组，感染后24 h ETECO101组肉鸡血清中TP(P<0.01)、ALB(P<0.01)、GLB(P<0.05)和GLU(P<0.01)含量显著降低，UREA(P<0.01)含量显著上升，对CREA水平影响不大。相对于ETECO101组，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著增加了血清中TP(P<0.01)和ALB(P<0.01)含量，粘菌素组增加TP(P<0.01)和ALB(P<0.05)含量的效果次之，100 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著增加TP含量(P<0.01)，但不增加ALB含量。200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组和粘菌素组显著降低了血清中UREA(P<0.01)含量。

表4 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡血清生化指标的影响(n=6)

相对于空白组，感染后第5天ETECO101组肉鸡血清中TP(P<0.01)、ALB(P<0.01)和GLB(P<0.01)含量显著升高，而UREA(P<0.01)、GLU(P<0.01)和CREA(P<0.01)含量显著下降。相对于ETECO101组，各给药组显著降低了血清中GLB(P<0.01)含量，显著增加了血清中UREA(P<0.01)含量，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著增加了血清中GLU(P<0.01)含量。

2.7 穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡血清丙二醛(MDA)含量的影响

穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡血清MDA含量的影响(图5)，相对于空白组，ETECO101组显著地增加了感染后24 h(P<0.01)和第5天肉鸡血清MDA的含量(P<0.05)；相对于ETECO101组，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著地降低了感染后24 h(P<0.01)和第5天(P<0.05)肉鸡血清MDA的含量；粘菌素组显著地降低了感染后24 h 肉鸡血清MDA的含量(P<0.01)。

图5 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡血清MDA含量的影响(n=6)

2.8 穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡血清超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响

穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡血清SOD活力的影响(图6)，相对于空白组，ETECO101组显著降低了感染后第5天肉鸡血清SOD活力(P<0.01)，但感染后24 h差异不显著；相对于ETECO101组，粘菌素组显著升高了感染后24 h肉鸡血清SOD活力(P<0.01)，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组升高效果次之(P<0.05)；各给药组均显著升高了感染后第5天肉鸡血清SOD活力(P<0.01)。

图6 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡血清SOD活力的影响(n=6)

2.9 穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响

穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡血清GSH-Px活力的影响见图7。相对于空白组，ETECO101组显著降低了感染后24 h肉鸡血清GSH-Px活力(P<0.01)，但感染后第5天差异不显著；相对于ETECO101组，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著升高了感染后24 h肉鸡血清GSH-Px活力(P<0.001)；粘菌素组显著升高了感染后第5天肉鸡血清GSH-Px活力(P<0.01)，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组升高效果次之(P<0.05)。

图7 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡血清GSH-Px活力的影响(n=6)

2.10 穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡肠道组织形态的影响

穿心莲内酯干混悬剂对肉鸡空肠组织形态的影响见图8及表5，相对于空白组，ETECO101组显著降低了感染后24 h肉鸡空肠绒毛高度(P<0.05)和绒毛高度与隐窝深度的比例(P<0.01)，显著增加了肉鸡空肠隐窝深度(P<0.05)；相对于ETECO101组，100和200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组和粘菌素组显著增加了感染后24 h肉鸡空肠绒毛高度(P<0.05)，降低了隐窝深度(P<0.05)；各给药组均显著增加了绒毛高度与隐窝深度的比例(P<0.01)。相对于空白组，ETECO101组显著降低了感染后第5天肉鸡空肠绒毛高度(P<0.05)和绒毛高度与隐窝深度的比例(P<0.01)，显著增加了肉鸡空肠隐窝深度(P<0.05)；相对于ETECO101组，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著增加了感染后第5天肉鸡空肠绒毛高度(P<0.05)和绒毛高度与隐窝深度的比例(P<0.01)，降低了隐窝深度(P<0.05)；粘菌素组显著增加了感染后第5天肉鸡空肠绒毛高度(P<0.01)和绒毛高度与隐窝深度的比例(P<0.05)，降低了隐窝深度(P<0.05)。

表5 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡空肠组织形态的影响(n=6)

图8 穿心莲内酯干混悬剂对ETECO101感染肉鸡第5天空肠形态结构的影响(100×)

3 讨论

穿心莲内酯是清热解毒中药穿心莲的主要药效成分，穿心莲内酯及其水溶性盐“穿琥宁”、“炎琥宁”、“莲必治”、“喜炎平”等多种制剂在医学临床上广泛用于呼吸道及消化道感染及炎症性疾病的治疗[24]。兽医上只批准了穿心莲内酯原料药，没有任何批准使用的制剂。本研究针对养鸡业通常采用饮水给药的投药途径，研制出适用于饮水给药的穿心莲内酯干混悬剂，全面考察了该制剂对产肠毒素性大肠杆菌ETECO101感染肉鸡的治疗效果。结果表明，穿心莲内酯干混悬剂饮水给药能显著提高大肠杆菌感染肉鸡的存活率，减轻感染鸡只的临床病症及腹泻。

生长性能是衡量药物对鸡只保护效果的重要指标。临床上肠毒素性大肠杆菌会引起肉鸡严重的肠道损伤和死亡，降低肉鸡的体重、采食量和饲料转化效率[25]。本试验发现，ETECO101感染导致肉鸡体重和采食量下降。产肠毒素性大肠杆菌感染肉鸡后在肠道中大量增殖，释放出毒素，致使肠黏膜脱落，屏障功能被破坏，肉鸡对营养物质的吸收和转化下降[26]。本试验证明，饮水中添加穿心莲内酯干混悬剂，能够有效地增加感染肉鸡的采食量和体重。张霞等[27]研究表明,穿心莲内酯可直接破坏内毒素结构，并抑制其所介导释放的大量炎性因子的活性而起到拮抗内毒素的作用。郑晨等[28]研究还发现，穿心莲内酯可显著改善内毒素导致的机体发热。而本研究前期药敏试验发现，穿心莲内酯对于产肠毒素性大肠杆菌无直接抑菌作用，其作用可能是通过抑制大肠杆菌释放的内毒素，从而抑制大肠杆菌在肉鸡肠道中的定植，改善肉鸡腹泻。

免疫器官指数在一定程度上反映了机体免疫功能的强弱，是评价家禽免疫力的重要指标，包括胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数[29]。王俊峰等[30]研究发现，日粮中添加乳酸菌制剂可以提高肉鸡法氏囊指数，但是对于后期法氏囊指数无显著改变。本研究发现，肉鸡感染ETECO101 24 h后，法氏囊指数显著下降，饮水中添加穿心莲内酯干混悬剂能够显著增加肉鸡法氏囊指数，感染后期随着机体免疫力地增强，穿心莲内酯干混悬剂对于肉鸡免疫器官指数的改善效果不明显。说明当病原体入侵机体后，机体的抵抗力显著下降，而穿心莲内酯可以通过调节机体，增强其免疫力，在一定程度上抵抗病原体的入侵。

正常情况下，机体自由基的产生和清除保持平衡，但在病原体入侵的情况下，体内自由基增加，氧化能力超过抗氧化能力而发生氧化应激，从而直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性最后导致细胞死亡或凋亡，造成组织损伤和疾病发生[31]。MDA是脂质过氧化反应产物，其含量可以体现氧自由基的含量和脂质过氧化程度。SOD和GSH-Px通过清除超氧阴离子(O2-)而保护细胞免受损伤，它们活性的高低间接反映机体清除自由基的能力，也就是机体抗氧化的能力[29]。何思蓉等[32]研究表明，穿心莲内酯能在中枢神经和外周血管中产生抗氧化作用而达到对机体的保护作用。其抗氧化作用主要可以归结为抑制自由基生成，防止脂质过氧化，从而降低自由基毒性[33]。本试验发现，肉鸡感染产肠毒素性大肠杆菌ETECO101后，发生氧化应激，感染细菌后24 h肉鸡血清中MDA含量上升，血清GSH-Px活力下降，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组显著降低了感染细菌后24 h肉龄肉鸡血清中MDA含量，升高了SOD和GSH-Px活力。肉鸡感染产肠毒素性大肠杆菌ETECO101后第5天血清中MDA含量上升，SOD活力显著下降，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组可以显著降低了肉鸡血清中MDA含量，升高SOD活力。说明穿心莲内酯可以通过降低血清MDA含量，升高SOD和GSH-Px活力来改善肉鸡血清的氧化应激状态。

小肠不仅是主要的消化吸收器官，而且还起到保护性屏障的作用，以防止肠腔内抗原、微生物和毒素渗透进入内部环境。然而，肠病原体如肠毒素性大肠杆菌，容易在小肠中定殖并释放出肠毒素，从而引起严重的腹泻并损害肠屏障完整性[34]。小肠的黏膜结构与功能完整性是保证机体能够充分吸收营养物质的前提。衡量肠黏膜功能的重要指标包括绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度与隐窝深度的比值[35]。从本试验可以看出，当肉鸡受到产肠毒性大肠杆菌ETECO101刺激后，肠绒毛变短、隐窝深度加深、绒毛高度与隐窝深度的比值下降。饮水中添加穿心莲内酯干混悬剂可以通过增加绒毛高度和降低隐窝深度，减少细菌感染对肠黏膜结构的损伤，增加肉鸡的营养吸收，另外，200 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组改善肠道形态的效果优于100 mg·L-1穿心莲内酯干混悬剂组。