乳腺癌组织中Bmi-1和CARD9表达及其与淋巴结转移和预后的关联*
2021-11-24张瑞瑞赵桓玉周武碧孙艳兰刘海燕
张瑞瑞 赵桓玉 周武碧 孙艳兰 刘海燕
(南京医科大学附属淮安第一医院病理科,江苏 南京 223300)
乳腺癌是发生于乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤,其发病率居女性恶性肿瘤之首,已严重影响了患者的生命健康[1-2]。目前,分子靶向技术已成为各类恶性肿瘤治疗的热点,但乳腺癌的靶向药物治疗效率低下且价格较为昂贵,故研究乳腺癌发生、发展的分析机制,并探索新的靶标是提高该疾病的治疗效率的重点[3-4]。Bmi-1基因属于转录抑制因子基因家族成员,调控细胞周期,并可通过结合INK4a位点,抑制pRb和p53蛋白介导的细胞凋亡,导致细胞生化、恶变甚至肿瘤化[5]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containingprotein 9,CARD9)是一个重要的衔接蛋白,可调节核转录因子等信号通路,与胃癌、肾癌等多种恶性肿瘤存在者密切联系[6],但目前其与乳腺癌发生、发展过程的联系至今尚无定论。故本研究通过分析乳腺癌患者癌组织及癌旁组织的Bmi-1、CARD9表情情况,旨在探究癌组织中Bmi-1、CARD9表达与淋巴结转移、预后的关联性,为乳腺癌的治疗及病情预测提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 经我院伦理委员会审核通过,以2017年1月~2018年11月96例乳腺癌患者为研究对象。纳入标准:①符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2015版)》[7]中关于乳腺癌的诊断标准,并经病理学检查确诊为乳腺癌患者。②患者知晓本研究的研究内容,且已签署同意书。③均行手术治疗。④临床资料完整者。排除标准:①严重肝肾功能异常者。②乳腺良性肿瘤患者。③其他原发性恶性肿瘤疾病患者。④入组前1个月内有激素替代治疗史患者。⑤入组前已接受手术或放化疗治疗者。⑥妊娠或哺乳期妇女。
1.2 方法 标本采集:取距病灶边缘>3 cm处的癌旁非肿瘤组织(经快速病理学检查证实为正常组织)0.1 g及肿瘤组织0.2g。Bmi-1表达检测:采用免疫组化法乳腺癌组织及癌旁组织中Bmi-1表达情况,应用北京中衫公司的免疫组化试剂盒,石蜡标本连续4um切片,将切片放置于二甲苯中脱蜡,10 min/次,共2次,然后行乙醇梯度水化处理,蒸馏水冲洗15 min,应用EDTA修复液进行常规修复,在微波炉中高火3 min预热至沸腾,然后中低火加热20 min以暴露抗原位点,待其自然冷却后,应用1‰的PBS溶液冲洗3次,紧接着用3%H2O2去离子水孵育10 min;在溶液中滴加美国upatate公司的鼠抗人Bmi-1单克隆抗体(稀释度为1∶200),在4℃下孵育过夜,然后用PBS溶液漂洗3次,5 min/次,滴加北京中衫公司SPKIT A液后在室温下孵育15 min,用PBS溶液漂洗后滴加B液,在室温下孵育10~15 min后再次应用PBS溶液漂洗3次,DBA显色10 min,终止显色,用PBS液代替一抗做阴性对照,Bmi-1阳性表达判断标准:光学显微镜下可观察到阳性表达的细胞核内呈棕黄色或棕褐色颗粒。CARD9表达检测:用二甲苯进行脱蜡处理,并用醇梯度洗脱,应用0.3#过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性,然后将组织切片与CARD9兔抗人单克隆抗体(美国Abcam公司)在4℃下孵育过夜,随后与辣根过氧化物酶在室温下温育30 min,用SP法显示免疫反应性,用PBS液代替一抗做阴性对照。CARD9表达判断标准:阴性为未见阳性染色细胞,阳性为可见深棕黄色或淡黄色细胞着色,每个切片至少观察5个视野。
1.3 观察指标 ①比较乳腺癌组织及癌旁组织中Bmi-1、CARD9表达情况。②统计患者临床病理资料,包括年龄、TNM分期、病理类型、组织学分级、淋巴结转移等,比较乳腺组织中Bmi-1、CARD9阳性表达及阴性表达患者病理资料的差异性,并分析影响乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达的危险因素。③预后:所有患者均术后术后随访1年,采用电话随访的方式对患者生存情况进行随访,比较乳腺组织中Bmi-1、CARD9阳性表达及阴性表达患者的1年生存率及死亡率,并分析乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况对术后1年生存情况的预测价值。
1.4 统计学分析 采用SPSS 23软件行统计学分析,计数资料以百分比表示,采用2检验比较组间差异;计量资料经正态检验后以均数±标准差表示,用t检验比较组间差异;采用多元logistics回归分析影响乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达的危险因素;采用Log-rank检验对生存曲线进行比较;采用ROC曲线分析乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况对术后1年生存情况的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者病理类型 患者年龄39~72岁,平均(52.31±7.18)岁;TNM分期:Ⅰ期19例、Ⅱ期23例、Ⅲ期29例、Ⅳ期25例;病理类型:浸润性癌36例、髓样癌29例、黏液腺癌31例;组织学分级:Ⅰ级43例、Ⅱ级30例、Ⅲ级23例;肿瘤长径:≥2 cm 38例、<2 cm 58例;存在淋巴结转移者34例。
2.2 乳腺癌组织及癌旁组织中Bmi-1、CARD9表达情况分析 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05),见表1。
表1 乳腺癌组织及癌旁组织中Bmi-1、CARD9表达情况分析[n,n(×10-2)]
2.3 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况与临床病理关系 Bmi-1阳性表达组在TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期、组织学分级为Ⅲ级、肿瘤长径≥2 cm、存在淋巴结转移、ER+方面的人数比例高于Bmi-1阴性表达组,CARD9阳性表达组在TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期、肿瘤长径≥2 cm、存在淋巴结转移方面的人数比例高于CARD9阴性表达(P<0.05),见表2。
表2 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况与临床病理关系
2.4 影响乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达的多因素分析 TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期、肿瘤长径≥2cm、存在淋巴结转移是影响Bmi-1表达的危险因素,TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期、存在淋巴结转移是影响CARD9表达的危险因素(P<0.05),见表3。
表3 影响乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达的多因素分析
2.5 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况与预后关系 Bmi-1、CARD9不同表达情况的1年生存率对比无明显差异(P>0.05),见表4、图1。
图1 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达与预后的生存曲线分析
表4 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况与预后关系[n,n(×10-2)]
2.6 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况对预后的预测价值 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况预测患者术后1年生存情况的AUC分别为0.561、0.628,见表5、图2。
表5 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况对预后的预测价值
图2 乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况预测术后1年生存情况的ROC曲线分析
3 讨论
Bmi-1基因PcG家族中的核心成员之一,对胚胎期哺乳动物骨骼、造血及神经的发育发挥重要作用,其具有阻抑子功能,可阻断细胞周期中两种关键抑制蛋白,并可与c-myc协同作用引起细胞转化和肿瘤形成[8-9]。CARD9是CARD蛋白家族中的一员,定位于细胞质中,并存在于人体多种组织中,同时在多种癌细胞系中有大量表达,提示其或与肿瘤的生长增殖有关[10-13]。本研究对乳腺癌组织及癌旁组织中Bmi-1、CARD9表达情况进行分析,结果发现乳腺癌组织Bmi-1、CARD9阳性表达率均高于癌旁组织,表明乳腺癌细胞中存在Bmi-1、CARD9高表达的现象。
相关报道指出,多种肿瘤细胞中Bmi-1呈现为高表达状态,使肿瘤细胞不断更新成为癌症干细胞,其表达水平与肿瘤的发生、发展、侵袭、预后等病理指标相关[14-16]。但目前尚不知其与乳腺癌的病理特征的关系,为此本研究进行了相关研究,结果发现TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期、肿瘤长径≥2cm、存在淋巴结转移是影响Bmi-1表达的危险因素,说明Bmi-1表达与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移有关,这可能是与Bmi-1基因可激活端粒酶逆转录酶的转录,诱导端粒酶活性,而促进肿瘤增殖有关[17-19]。CARD9为衔接蛋白,可通过蛋白间的相互作用调节NF-kB等信号通路,调控肿瘤坏死因子、白介素等免疫因子的表达,并能调节机体固有免疫反应,对于维持机体微环境的稳态发挥着重要作用[20-22]。局部微环境的炎症反应是诱导癌症发生、发展的重要因素,慢性炎症可促进癌症的发生,并参与了肿瘤发生、转移等的病理过程[23]。有研究指出,CARD9表达情况与肿瘤的恶性程度有关[24-25]。本研究结果显示,TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期、存在淋巴结转移是影响CARD9表达的危险因素,表明,这主要是因为CARD9异常表达可促进病理炎症反应的发生,而炎症参与了肿瘤的发生,引起未恶化的癌细胞扩增,促进血管生成,有利于肿瘤细胞的生长、扩增,也促进恶性肿瘤细胞扩散,进而导致肿瘤出现淋巴结转移现象[26-27]。
经上述研究可知,Bmi-1、CARD9表达与乳腺癌的发生发展过程的存在一定的联系,提示其表达情况或与预后相关。但本研究发现,Bmi-1、CARD9不同表达情况的1年生存率对比无明显差异,乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9表达情况预测患者术后1年生存情况的AUC均小于0.7,表明Bmi-1、CARD9表达情况与预后无较大关联,且对预后的预测价值较低,与既往研究结果存在差异[28-39],这可能与本研究样本量少、且研究时间尚短有关,故后期需延长预后观察时间,以进一步分析Bmi-1、CARD9表达与预后的关系。本研究不足之处在于,纳入病例的TNM分期及病理类型的人数比例并不均匀,可能对研究结果造成误差,并且本研究在进行预后分析时,观察时间较短,未分析术后3年、5年生存率,无法准确得到Bmi-1、CARD9表达与预后的关系,故后续需延长研究时间以分析其与预后的关联。
4 结论
本研究结果显示,乳腺癌组织中Bmi-1、CARD9阳性表达率较高,且其阳性表达与淋巴结转移、TNM分期相关,但Bmi-1、CARD9表达情况与术后1年生存情况无明显关联。