理中汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠胃黏膜保护作用及对ADAM17、EGFR蛋白的影响*

白雪峰，谭 娟，高 枫

（1.延安大学附属医院，陕西 延安 716000；2.延安大学医学院基础医学教研室，陕西 延安 716000）

慢性萎缩性胃炎是临床常见的消化道疾病之一，其发病机制与幽门螺杆菌感染、缺铁性贫血等密切相关。此外，本病还与饮食结构及遗传因素有关[1]。由于慢性萎缩性胃炎发病机制复杂，目前对于慢性萎缩性胃炎患者的临床治疗一般是采用保护胃黏膜等对症治疗方式，但有效率有限且复发率较高[2]，故对于慢性萎缩性胃炎的治疗药物研发仍是临床工作重点。近年来研究发现[3]，ADAM17及EGFR蛋白水平的异常与慢性萎缩性胃炎等消化道疾病的发生发展及癌变过程有关，且ADAM17及EGFR蛋白的异常激活能够升高慢性萎缩性胃炎复发率，降低幽门螺杆菌根除率，导致胃黏膜病理损伤加重。现代医学研究表明[4]理中汤对慢性萎缩性胃炎等消化道疾病具有一定作用，且在临床应用中已表现出显著疗效。本实验通过研究理中汤对慢性萎缩性胃炎大鼠的作用及机制，旨在为理中汤治疗慢性萎缩性胃炎提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物6周龄SPF级雄性SD大鼠72只，体质量180～200 g，购自陕西医药控股集团生物制品有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（陕）2017-001，饲养于实验动物房，温度20～25℃，湿度40%～70%，明暗交替12 h/12 h，于动物房饲养1周后进行实验。实验动物使用及处理经延安大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 理中汤方药组成：人参、干姜、炙甘草、白术各9 g，将药材饮片置于1 500 mL蒸馏水中煎煮2 h，过滤残渣，加入1 000 mL蒸馏水再次煎煮1 h，过滤除去残渣，合并滤液，浓缩制成每毫升含2 g生药的汤剂，装瓶低温保存；人参（批号：20181104）、干姜（批号：20181213）、炙甘草（批号：20190707）、白术（批号：20180910）均购自北京同仁堂药业；维酶素（四川大冢制药有限公司，批号：2020041311）；PCR反应试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：G3320-15）；Trizol总RNA抽提试剂（货号：R0016）、cDNA合成试剂盒（货号：D7170L）、大鼠IL-1β ELISA试剂盒（货号：PI303）均购自碧云天生物科技有限公司；ADAM17兔多克隆抗体（货号：PA5-27395）、EGFR兔单克隆抗体（货号：MA5-13070）、GAPDH兔单克隆抗体（货号：MA1-16757）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（货号：A32731）均购自赛默飞世尔科技有限公司；高效RIPA裂解液（货号：R0010）、ECL Plus超敏发光液（货号：PE0010）、HE染色试剂盒（货号：G1120）、大鼠IL-8 ELISA试剂盒（货号：SEKR-0071）、IL-12 ELISA试剂盒（货号：SEKR-0057）均购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠胃泌素（gastrin，GAS）ELISA试剂盒（货号：SND-R747）、MTL ELISA试剂盒（货号：SND-M221）均购自滁州仕诺达生物科技有限公司；PCR引物设计及合成由江苏凯基生物技术股份有限公司完成。

1.3 主要仪器MF52荧光倒置显微镜（广州市明美光电技术有限公司）；TGL-22S高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）；T100梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司）；SpectraMax M3酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；HM355S全自动轮转式石蜡切片机（上海聚慕医疗器械有限公司）；Omega Fluor凝胶成像系统凝胶成像仪（美国Aplegen公司）；YP2002电子天平（上海佑秤仪器仪表有限公司）。

1.4 造模与分组 从72只大鼠中随机取12只作为对照组，其余大鼠饮用0.04 g/mL的N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG）溶液，采用饱食2 d，禁食1 d的饥饱失常饮食控制法，同时按照0.03 g/kg的剂量灌胃给予雷尼替丁，1次/d，建立慢性萎缩性胃炎大鼠模型[5]，连续20周。随机取3只大鼠（对照组1只，造模组2只）处死后分离胃组织，观察组织病理学改变，与对照组比较，以造模大鼠胃黏膜组出现点片状红斑及出血点，胃黏膜细胞坏死脱落、腺体减少视为造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组（11只）、维酶素组（12只）、理中汤高剂量组（11只）、理中汤中剂量组（12只）和理中汤低剂量组（12只）。

1.5 实验给药 所有大鼠称体质量后，理中汤低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予5、10、15 g/kg[6]的理中汤（以生药含量计）溶液，维酶素组大鼠灌胃给予0.7 g/kg的维酶素溶液[7]，对照组及模型组大鼠灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，连续10周[7]，再次对各组大鼠进行称体质量。

1.6 观察指标

1.6.1 血清GAS及血浆MTL大鼠麻醉后取仰卧位，腹主动脉取血，每组取6只大鼠血样置于干净离心管中，4℃条件下静置2 h，8 000 r/min，4℃离心10 min，取上清，测定血清GAS水平，另取6只大鼠血液置于肝素润洗过的离心管中混匀，8 000 r/min，4℃离心10 min，取上清，测定血浆MTL水平。

1.6.2 胃组织IL-1β、IL-8、IL-12水平 大鼠颈椎脱臼法处死后取胃组织，加入磷酸盐缓冲液研磨匀浆后，室温条件下，8 000 r/min离心15 min，取上清，使用大鼠IL-1β、IL-8、IL-12 ELISA试剂盒测定胃组织IL-1β、IL-8、IL-12水平。

1.6.3 HE染色观察大鼠胃组织病理变化 分离胃组织，使用中性甲醛固定24 h，石蜡包埋后进行5 μm切片，常规HE染色后，显微镜下进行组织病理学观察。

1.6.4 RTq-PCR测定胃组织EGFR mRNA、ADAM17 mRNA表达水平 取大鼠胃组织，应用Trizol试剂盒提取大鼠胃组织总RNA，根据cDNA合成试剂盒说明书方法，将mRNA逆转录为cDNA，根据PCR反应试剂盒进行荧光RTq-PCR，以β-actin为内参，测定各基因的相对表达量，结果采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量，各基因引物序列如下。β-actin：Forward：5'-CGACAGTCAGCCGCATCTTC-3'，Reverse：5'-GCATCACCCGGAGGAGAAAT-3'，长度210 bp；ADAM17：Forward：5'-GTGGAGCGATTAAACCGTGC-3'，Reverse：5'-GAACCCTTAAGCTAGGCGGG-3'，长度235 bp；EGFR：Forward：5'-CGCCGCCTTTGAACTGAAAA-3'，Reverse：5'-TCAGCAACATTTGCCAAGCC-3'，长度167 bp。

1.6.5 Western blotting测定胃黏膜EGFR及ADAM17蛋白表达 取大鼠胃组织匀浆液，离心取上清，加热变性后采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量，取50 μg蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到聚偏氟乙烯膜上，依次经β-actin、EGFR、ADAM17兔单克隆抗体（1∶500稀释）及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶1 000稀释）孵育后，用含吐温磷酸盐缓冲液洗涤10 min，化学发光试剂盒检测免疫反应条带，用ImageJ 1.48软件对蛋白条带进行量化分析。

1.7 统计学方法 使用SPSS 26.0进行数据分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠给药前后体质量比较 给药前，与对照组比较，模型组、维酶素组和理中汤低、中、高剂量组大鼠体质量明显降低（P<0.05），提示造模成功且大鼠饮食活动已明显改变。给药后，与对照组比较，模型组大鼠体质量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，理中汤低、中、高剂量组和维酶素组大鼠体质量明显升高（P<0.05），且呈剂量依赖性。与理中汤低、中剂量组比较，维酶素组大鼠体质量明显升高（P<0.05）；与维酶素组比较，理中汤高剂量组大鼠体质量明显升高（P<0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠给药前后体质量比较

表1 各组大鼠给药前后体质量比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与理中汤低剂量组比较，cP<0.05；与理中汤中剂量组比较，dP<0.05；与理中汤高剂量组比较，eP<0.05

组别 动物数（只） 给药剂量(g/kg)给药前 给药后对照组 11 - 376.29±1.61 464.91±0.88模型组 11 - 338.75±2.95a 387.07±0.64a理中汤低剂量组12 5.0 340.51±1.76a 410.79±0.81b理中汤中剂量组12 10.0 339.90±1.41a 432.04±0.68b c理中汤高剂量组11 15.0 341.04±2.73a 454.64±0.83b c d维酶素组 12 0.7 337.64±2.85a 438.84±1.12b c d e

2.2 各组大鼠血清GAS及血浆MTL水平比较 与对照组比较，模型组大鼠血清GAS水平及血浆MTL水平均明显降低（P<0.05）；与模型组比较，理中汤低、中、高剂量组及维酶素组大鼠血清GAS水平及血浆MTL水平均明显升高（P<0.05），且呈剂量依赖性。与理中汤低、中剂量组比较，维酶素组大鼠血清GAS水平及血浆MTL水平均明显升高（P<0.05）；与维酶素组比较，理中汤高剂量组大鼠血浆MTL水平明显升高（P<0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清GAS及血浆MTL水平比较，pg/mL）

表2 各组大鼠血清GAS及血浆MTL水平比较，pg/mL）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与理中汤低剂量组比较，cP<0.05；与理中汤中剂量组比较，dP<0.05；与理中汤高剂量组比较，eP<0.05

组别 动物数（只） 给药剂量(g/kg) GAS MTL对照组 6 - 82.18±1.66 513.82±2.84模型组 6 - 43.23±2.36a 327.91±3.23a理中汤低剂量组6 5.0 51.22±1.45b 390.60±2.29b理中汤中剂量组6 10.0 64.56±1.15b c 431.44±2.03b c理中汤高剂量组6 15.0 73.34±1.25b c d 476.80±1.48b c d维酶素组 6 0.7 75.17±0.13b c d 438.68±1.59b c d e

2.3 各组大鼠胃组织IL-1β、IL-8、IL-12水平比较 与对照组比较，模型组大鼠胃组织IL-1β、IL-8、IL-12水平均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，理中汤低、中、高剂量组及维酶素组大鼠胃组织IL-1β、IL-8、IL-12水平均明显降低（P<0.05），且呈剂量依赖性。与理中汤低、中剂量组比较，维酶素组大鼠胃组织IL-1β、IL-8、IL-12水平均明显降低（P<0.05）；与维酶素组比较，理中汤高剂量组大鼠胃组织IL-8、IL-12水平均明显降低（P<0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠胃组织IL-1β、IL-8、IL-12水平比较s，pg/mL）

表3 各组大鼠胃组织IL-1β、IL-8、IL-12水平比较s，pg/mL）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与理中汤低剂量组比较，cP<0.05；与理中汤中剂量组比较，dP<0.05；与理中汤高剂量组比较，eP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量(g/kg)IL-1β IL-8 IL-12对照组 5 - 11.24±0.11 8.11±0.37 10.11±0.23模型组 5 - 47.49±1.23a 56.57±2.21a 34.62±0.37a理中汤低剂量组6 5.0 36.41±0.24b 44.12±1.29b 26.71±0.47b理中汤中剂量组6 10.0 24.66±0.19bc 27.29±1.45bc 20.81±0.52bc理中汤高剂量组5 15.0 16.18±0.25bcd 14.64±0.92bcd 12.52±0.82bcd维酶素组 6 0.7 17.76±0.48bcd 17.38±1.13bcde 16.04±0.33bcde

2.4 各组大鼠胃黏膜病理形态比较 对照组大鼠胃黏膜组织细胞排列整齐，无明显病理性改变；与对照组比较，模型组大鼠胃黏膜组织被破坏，腺体丢失，炎症细胞浸润，组织结构破坏，提示造模成功；与模型组比较，理中汤低、中、高剂量组及维酶素组大鼠胃黏膜病理改变恢复，炎症细胞浸润减轻，胃黏膜组织排列较整齐，细胞结构和腺体数目逐渐恢复，且随着理中汤剂量的增加，大鼠胃黏膜组织炎症细胞浸润减少更明显，胃黏膜组织病理学恢复更显著。（见图1）

图1 各组大鼠胃黏膜病理形态比较（HE，×200）

2.5 各组大鼠胃组织EGFR mRNA、ADAM17 mRNA表达比较 与对照组比较，模型组大鼠胃组织EGFR mRNA、ADAM17 mRNA相对表达量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，理中汤低、中、高剂量组及维酶素组大鼠胃组织EGFR mRNA、ADAM17 mRNA相对表达量明显降低（P<0.05），且呈剂量依赖性。与理中汤低、中剂量组比较，维酶素组大鼠胃组织EGFR mRNA、ADAM17 mRNA相对表达量明显降低（P<0.05）；与维酶素组比较，理中汤高剂量组大鼠胃组织ADAM17 mRNA相对表达量明显降低（P<0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠胃组织EGFR mRNA、ADAM17 mRNA相对表达量比较（s）

表4 各组大鼠胃组织EGFR mRNA、ADAM17 mRNA相对表达量比较（s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与理中汤低剂量组比较，cP<0.05；与理中汤中剂量组比较，dP<0.05；与理中汤高剂量组比较，eP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量(g/kg)ADAM17 mRNA EGFR mRNA对照组 5 - 1.05±0.23 0.84±0.12模型组 5 - 5.11±0.79a 6.26±0.54a理中汤低剂量组6 5.0 4.02±0.38b 4.84±0.32b理中汤中剂量组6 10.0 3.10±0.23b c 3.64±0.36b c理中汤高剂量组5 15.0 1.34±0.30b c d 1.41±0.21b c d维酶素组 6 0.7 2.61±0.31b c d e 1.89±0.44b c d

2.6 各组大鼠胃组织EGFR、ADAM17蛋白表达比较 与对照组比较，模型组大鼠胃组织EGFR、ADAM17蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，理中汤低、中、高剂量组及维酶素组大鼠胃组织EGFR、ADAM17蛋白相对表达量明显降低（P<0.05），且呈剂量依赖性。与理中汤低、中剂量组比较，维酶素组大鼠胃组织EGFR、ADAM17蛋白相对表达量明显降低（P<0.05）；与维酶素组比较，理中汤高剂量组大鼠胃组织EGFR蛋白相对表达量明显降低（P<0.05）。（见图2）

图2 各组大鼠胃组织EGFR、ADAM17蛋白相对表达量比较（

3 讨 论

慢性萎缩性胃炎是以胃痛、胃胀、嗳气、食欲不振等为主要临床表现的消化道常见疾病，其发病机制与幽门螺杆菌感染、饮食习惯、遗传因素及放射因素等多种因素相关。慢性萎缩性胃炎在病理组织学方面表现为胃黏膜萎缩，腺体数目减少，严重者可伴有幽门腺化生及肠腺化生，如不及时干预，慢性萎缩性胃炎可伴有胃出血、贫血及胃癌前病变等多种并发症[8]。目前临床中对于慢性萎缩性胃炎的治疗多采用抗幽门螺杆菌、抑制胆汁反流、改善胃动力、保护胃黏膜等多种对症治疗方式，然而这些治疗方案表现出有效率低且复发率高的缺点，加之患者病因复杂，所以对于慢性萎缩性胃炎的治疗仍是目前临床所面临的难题之一，新的治疗慢性萎缩性胃炎的药物研发也是目前的工作重点。

理中汤中干姜为君药，归脾胃经，具有温中散寒、祛散寒邪、回阳通脉的功效；人参为臣药，具有补气健脾、复脉固脱的功效；白术为佐药，有健脾益气、燥湿利水的作用；炙甘草为使药，调和诸药，同时具有补脾和中的功效。全方合用，共奏温中散寒、补益脾胃之功效，对脾胃虚寒、腹满食少等症状疗效显著。现代医学研究表明理中汤对急慢性胃炎、胃溃疡等多种消化系统疾病具有显著疗效。曲锋[9]通过临床观察研究表明，理中汤能够减少脾胃虚寒所致慢性胃炎患者的胃脘胀痛、食少纳呆、恶心呕吐等临床症状，且不良反应少，安全性好；姚春和等[10]通过研究理中汤对慢性萎缩性胃炎的临床疗效发现，理中汤联合替普瑞酮的患者体内胃泌素、胃动素及氧化应激水平均低于单独使用替普瑞酮的患者，并且理中汤联合替普瑞酮能够纠正患者体内生长抑素水平，改善慢性萎缩性胃炎患者预后；高峻鹰等[11]通过研究发现理中汤能够通过降低炎症因子水平发挥对脾胃虚寒型复发性口腔溃疡的治疗作用，并降低复发率。因此，理中汤对于慢性萎缩性胃炎等疾病的药理作用及机制值得进一步探讨。

GAS是由胃窦细胞及十二指肠黏膜细胞分泌的一种胃肠激素，能够促进胃酸的分泌及胃肠的蠕动。研究表明[12]，GAS的水平反映了胃黏膜组织病理状态，当胃黏膜萎缩及腺体功能降低时，GAS水平则显著降低；MTL的作用是促进胃肠道收缩运动。李加虎等[13]研究发现慢性萎缩性胃炎患者体内GAS及MTL水平显著降低；独思静等[14]研究表明慢性萎缩性胃炎大鼠体内GAS及MTL水平降低，且其降低程度与大鼠胃黏膜萎缩程度及病理进展有关。IL-1β、IL-8及IL-12水平是评价慢性萎缩性胃炎胃黏膜炎症反应的重要指标。王旭峰等[15]研究发现慢性萎缩性胃炎患者血清IL-1β升高，而通过抑制IL-1β则能够逆转胃黏膜病理改变，提高幽门螺杆菌根除率；蔡红妃等[16]研究表明血清IL-8水平与慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜病理分级相关，降低IL-8水平能够改善胃黏膜形态；李赛莲等[17]研究表明慢性萎缩性胃炎患者体内IL-12水平升高，下调患者血清IL-12水平能够提高患者幽门螺杆菌转阴率，降低患者胃黏膜炎症反应。本实验结果表明，与模型组比较，理中汤低、中、高剂量组大鼠给药后体质量、血清GAS水平及血浆MTL水平显著升高，胃黏膜组织IL-1β、IL-8、IL-12水平降低，胃黏膜组织病理学改善。这提示理中汤能够呈剂量依赖性地降低大鼠血清炎症水平，纠正大鼠体内慢性炎症状态，并改善胃肠道激素水平，恢复大鼠胃组织正常功能及生理活动，修复胃黏膜组织损伤。

ADAM17是与胃癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤疾病的发生，以及肿瘤细胞增殖、黏附和迁移相关的基因[18]。近年来研究[3]表明，慢性萎缩性胃炎动物模型体内，其胃组织细胞中ADAM17的过度表达能够异常激活EGFR通路，促进胃黏膜上皮细胞过度增殖，并诱导已经发生炎症性病理改变的胃组织癌变，由此可见胃黏膜组织ADAM17及EGFR等蛋白水平的异常表达对于胃癌等疾病的发生具有一定的促进作用。同时，杨幼新等[19]研究表明，EGFR通路的异常激活与慢性萎缩性胃炎癌前病变患者胃黏膜萎缩、肠化及异型增生的发生及预后密切相关；任守忠等[20]研究表明EGFR通路过度激活能够加重胃黏膜炎症细胞浸润程度及面积，而抑制胃黏膜EGFR通路蛋白的表达则能够阻止炎症细胞过度增殖及胃黏膜组织癌变，由此可见抑制胃黏膜炎症性病变组织ADAM17及EGFR蛋白的过表达是治疗胃组织病变及预防癌变的重要手段。本实验结果表明，与模型组比较，理中汤低、中、高剂量组大鼠胃黏膜EGFR及ADAM17的mRNA及蛋白水平显著降低，表明理中汤能够呈剂量依赖性地抑制慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜ADAM17、EGFR蛋白水平的异常升高，进而起到修复胃黏膜，恢复胃黏膜组织功能的作用。本实验通过研究理中汤对慢性萎缩性胃炎的改善作用，并通过研究其对ADAM17及EGFR蛋白的调节作用，初步阐述了理中汤的可能分子机制，为研究理中汤治疗慢性萎缩性胃炎的药理作用提供了新的参考和依据。

综上所述，理中汤能够修复慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜损伤，恢复胃黏膜功能，抑制病理进展，其机制可能与调节ADAM17、EGFR蛋白水平有关。