疏肝理脾汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肠道菌群多样性和丰富度的影响*

王 雅，代 静，刘先姜，张 涛

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在我国慢性肝病疾病谱中的占比逐年增长[1]。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）属于NAFLD一部分，是在单纯非酒精性脂肪肝轻度脂肪病变基础上发生炎症反应的一类疾病，增加了终末期肝病发生风险[2]。近年多项研究证实肠道微生物可影响肠道固有层免疫细胞，而其通过免疫识别受体作用肝细胞，导致肝脏炎症反应。修复肠道免疫屏障功能，恢复其屏障功能以减轻肝脏炎症反应，能阻断NAFLD向NASH进展[3]，“菌-肠-肝”轴理论的提出为防治NASH的发生、发展提供理了论基础[4]。疏肝理脾汤源于柴芍六君子汤，有改善肝脏炎症、纤维化的疗效[5]，但尚无关于其对肠道菌群调节方面的研究。因此，本研究以“菌-肠-肝”理论为依据，运用16srRNA高通量测序法，观察疏肝理脾汤对NASH大鼠肠道菌群的影响，现报告如下。

1 材 料

1.1 实验动物8周龄健康、成年SPF级雄性SD大鼠56只，体质量（180±10）g，由湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（湘）2013-0005，饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心，本次研究经过湖南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会批准，批件号：SYFY20170225，依照实验动物3R原则给予人道关怀。

1.2 饲料 蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饲料配方：L-氨基酸175.7 g/kg，玉蜀黍淀粉150.0 g/kg，右旋麦芽糖50.0 g/kg，玉米油100.0 g/kg，纤维素30.0 g/kg，碳酸氢钠7.4 g/kg，维生素混合物10.0 g/kg，盐混合物35.0 g/kg。

1.3 药物与试剂 疏肝理脾汤（方药组成：柴胡15 g，茯苓15 g，白芍15 g，白术10 g，砂仁5 g，甘草5 g）由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。传统中药法煎制，水浴浓缩至生药含量为2.0 g/mL，4℃保存备用。

粪便DNA小量提取试剂盒（美国Omega公司，批号：20190703）；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（美国AXYGEN公司，批号：20150606）；完全福氏佐剂F5881（美国Sigma公司，批号：9007-81-2）；不完全福氏佐剂F5506（美国Sigma公司，批号：SLBL9742V）。

1.4 主要仪器QuantiFluorTM ST蓝色荧光定量系统（美国Promega公司）；UC-7超薄切片机（德国莱卡公司）；透射电镜HT7700（日本日立高新技术公司）；电子显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.5 造模与分组 适应性喂养1周大鼠，从56只大鼠中随机选取8只作为正常对照组，剩余48只大鼠采用蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食联合慢性束缚应激刺激法复制NASH大鼠模型：造模大鼠给予蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食，每天投食量为10 g/100 g，每天饮水量为12 mL/100 g。参照国内肝郁脾虚证动物模型通行方法，给予饥饱失常饮食[6-7]，即第1天给予常规量MCD饮食，第2天禁食，均不禁水，同时给予慢性束缚应激刺激，即每日将小鼠放置于束缚制动筒内限制活动4 h，束缚开始时间不固定，同时保持束缚期间禁食、禁水。各大鼠每周称体质量，依照体质量调整投食量和饮水量。5周后，观察各组大鼠进食、饮水、行为、活动、精神状态、毛发及二便等情况，正常对照组与造模组分别随机抽取2只大鼠行肝脏病理切片检测，评判造模结果。将剩余46只造模成功大鼠依照随机数字表法分为模型组（15只）、疏肝理脾低剂量组（16只）、疏肝理脾高剂量组（15只）。

1.6 实验给药 给药期间所有大鼠均给予正常饮食。参照陈奇主编《中药药理研究方法学》计算给药量，折算后疏肝理脾高、低剂量组大鼠生药灌胃量分别为6.18、1.78 g/kg，灌胃体积为10 mL/kg；模型组和正常对照组大鼠灌胃给予等体积蒸馏水，均于每天14:30:00灌胃给药，1次/d，连续给药4周。末次给药后12 h禁食，称重，按体质量予以10%水合氯醛，0.35 mL/100 g标准对大鼠进行麻醉。

1.7 观察指标 给药第4周末，每组选取6只大鼠采集约1 g新鲜粪便，放入EP管中-80℃低温冰箱保存固定，进行16srRNA肠道菌群多样性检测。操作人员予D4015提取基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测。ABI GeneAmp 9700，TransGen AP221-02型仪按指定测序区域，合成barcode的特异引物。采用2%琼脂糖凝胶电泳法检测PCR混合产物，切胶回收PCR产物（AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司），进行Tris_HCI洗脱，2%琼脂糖电泳检测。引物序列号为338F ACTCC TACGGGAGGCAGCAG；806R GGA CTACHVGGGTWTCTAAT，参照电泳初步定量结果，运用QuantiFluortTM-ST蓝色荧光定量系统检测定量，而后予Miseq测序，分析肠道菌群16srRNA多样性。

1.8 统计学方法 首先对原始测序数据进行过滤处理，处理后的数据进行过滤得到有效数据，保证OTU（operational taxonomic units）聚类及后续分析的准确性，然后基于有效数据进行OTU聚类/去噪和物种分类分析，形成OTU和其他物种分类等级的物种丰度谱。基于数据均一化后的OTU物种丰度谱，再对OTU进行丰度、多样性指数等分析，并对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。Kruskal Wallis和ANOVA的分析运用qiime1 group_significance.py脚本，ANCOM的分析运用qiime2 composition ancom命令。ANCOM、Kruskal Wallis和ANOVA用于多组间丰度差异的显著性检验。Kruskal Wallis和ANOVA提供检验统计量（Test-Statistic），总的P值（P），校正错误发现率P值（FDR_P），Bonferroni校正P值（Bonferroni_P），以及各分组均值，但不提供多重比较的结果；ANOVA是参数检验，要求丰度服从正态分布，而大部分物种的丰度都是不服从正态分布的；Kruskal Wallis属于非参数检验，对分布没有要求，较为适合菌群分析。LEfSe方法是非参数检验和线性判别分析的结合，适合菌群丰度差异检验。以上均采用R语言统计V4.0.1版统计软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 造模评价5周后，正常对照组大鼠毛发光泽，正常作息，饮食量及情绪无明显变化；造模组大鼠毛发晦暗，无光泽，前期表现极度易激惹，后期表现情绪低落，倦怠少运动，饮食量减少，大便稀溏等类似中医肝郁脾虚证之象。

光镜下正常对照组大鼠肝细胞形态规则，胞浆清透，大小一致，肝窦清晰；造模组可见弥漫性、大泡性脂肪变性及气球样变，腺泡内可见明显点、灶状坏死，散在可见淋巴细胞、炎症细胞浸润，提示造模成功（见图1）。

图1 大鼠肝脏组织病理检测（HE，×100）

2.2 肠道菌群测序序列分析、OUTs分析结果 共24份粪便样本采得3 276 796条序列，样本序列共测得数值计3 276 796，采得样本中最大序列数为90 623，最小序列数为35 102，平均序列数共计45 511.05。

2.3 大鼠肠道菌群OUTs分析结果 对所有样品进行样品物种组成及多样性信息分析。依照界水平（Kingdom）、门水平（Phylum）、纲水平（Class）、目水平（Order）、科水平（Family）、属水平（Genus）、种水平（Species）对所有样本通过Illumina MiSeq测序平台进行OTU绝对丰度信息聚类分析。对每个样品在界门纲目科属种7个分类水平上的序列数目占总序列数的比例进行统计，可以有效地评估样本的物种注释分辨率（注释到属/种的比例越高表示样本的OTU注释效果越好），图2展示了每个样本中OTU在各分类水平注释的相对程度。因注释到种水平的物种数量少，本研究主要对注释到门水平及属水平的物种进行统计分析。大鼠肝脏组织病理检测已证实此实验造模是成功的，两两比较结果表明，模型组与疏肝理脾低剂量组比较，差异无统计学意义（P>0.05），而疏肝理脾高剂量组与疏肝理脾低剂量组间存在一定差异，但差异不显著。而模型组与疏肝理脾高剂量组间在门水平上优势菌分别为厚壁杆菌、拟杆菌、变形菌和放线菌。门水平上两组间比较，差异无统计学意义（P>0.05），模型组与疏肝理脾高剂量组在属水平共得到75个属，丰度最高18个物属分别为乳酸杆菌属、瘤胃球菌属、示波螺旋藻属、瘤胃球菌属1、普氏菌属1、未特指的毛螺菌科属、普氏菌属、梭菌属、布劳特化菌属、类杆菌属、未特指的梭菌科属、未特指的梭菌属、未特指的类杆菌属、未特指的瘤胃球菌科属、未特指的消化链球菌科属、异杆菌属、未指定的肠杆菌科属、其他等。在模型组和疏肝理脾高剂量组，这18个菌群占了所有菌群丰度的82.2%和90.1%以上。与模型组比较，乳酸球菌属、考拉杆菌属、脱卤杆菌属、罗氏菌属、黏液杆菌属、葡萄球菌属、气球菌属、梭状芽孢杆菌属、昆虫肠道菌属、SMB53、瘤胃球菌属、费氏刺骨鱼菌属、大肠杆菌属、梭菌属、未指明的梭菌科属、霍尔德曼菌属、“A”凝聚杆菌属、小克里斯滕森氏菌等18种菌属等仅在疏肝理脾高剂量组被检测到，为疏肝理脾高剂量组所特有菌属，而模型组缺如；与疏肝理脾高剂量组比较，有7个菌属如脱硫弧菌属、未特指的丹毒丝菌属、念珠菌属、肠球菌属、耐盐咸海鲜球菌属、草酸杆菌属、柱状弧菌属仅在模型组中被检测到，为模型组所特有，而疏肝理脾高剂量组缺如；虽然这25个菌属丰度低（每个菌属所占比例<1%），但仍可提示与模型组比较，本研究中疏肝理脾高剂量组大鼠在属水平上肠道微生物发生了明显的变化。（见图3）

图2 各组大鼠肠道菌群OUTs分析图

图3 两个分组在属水平上的相对分布情况柱形图（相对丰度前20的物种）

图3示，模型组和疏肝理脾高剂量组大鼠肠道菌群物种的组成存在明显差异，优势菌群种类虽未发生变化，但所占的比例发生了变化。模型组的拟杆菌属、梭菌属、未指明的肠杆菌属少于疏肝理脾高剂量组，而劳特氏菌属、粪球菌属则有所增多。这5种菌群的变化特征与以往报道的非酒精性脂肪肝炎的肠道菌群变化相符[8-9]。值得观察的是疏肝理脾高剂量组大鼠的肠道菌群出现模型组所没有的菌群，如乳酸球菌属、考拉杆菌属等18种菌属，而模型组所具有的菌群如脱硫弧菌属、未特指的丹毒丝菌属等7种菌属却缺如，考虑为随着药物的使用，疏肝理脾高剂量组属水平的菌群种类多于模型组，提示大鼠肠道菌群的丰度及丰富度明显高于模型组。分析可能随着药物的治疗作用，疏肝理脾高剂量组大鼠肠道潜在有益菌占据了优势，数量与种类较正常组增多，而致病菌却失去了优势逐渐减少直至消失。

2.4 Beta多样性分析Beta多样性分析中Bray crutis距离表示样本间丰富度差异，样本之间距离越远，样本间物种丰富度差异越大；unweight unifrac距离反映样本间物种的有无，样本间距离相距越远，提示物种间差异性越显著。本研究通过分析Beta多样性指数，比较组间菌群结构间的差异性，观察NASH大鼠经过高剂量疏肝理脾汤治疗后肠道菌群结构的变化情况。结果提示模型组和疏肝理脾高剂量组Bray crutis及unweight unifrac均较远且无交集，两者在丰富度和物种组成方面有较大差异（见图4）。图5为基于Unweighted Unifrac距离进行的NMDS分析PERM ANOVA，经过比较，疏肝理脾高剂量组大鼠与模型组大鼠间有显著的差异，说明模型组和疏肝理脾高剂量组大鼠肠道菌群间存在显著差异。从图中可以预估出疏肝理脾高剂量组对NASH大鼠有一定的治疗作用，可能与大鼠肠道菌群改变相关。

图4 模型组与疏肝理脾高剂量组Bray crutis（左）、unweight unifrac（右）图

图5 基于Unweighted Unifrac距离进行的NMDS分析PERMANOVA

2.5 组间差异显著性分析 采用LEfSe（LDA Effect SiSe）法对模型组与疏肝理脾高剂量组组间进行特征性差异菌，分析属水平上的差异菌，LDA>4提示差异有统计学意义，以LDA>4.8为标准筛选本次分析中的特征性差异菌。（见图6）

图6 模型组（A）和疏肝理脾高剂量组（B）大鼠粪便差异菌LDA评分图图6模型组（A）和疏肝理脾高剂量组（B）大鼠粪便差异菌LDA评分图

图7显示模型组大鼠属水平丰度较高的菌群依次为普氏菌科、毛螺菌科、草酸杆菌科、韦荣氏球菌科。疏肝理脾高剂量组大鼠属水平丰度较高的菌群依次为拟杆菌科、土杆菌科、土杆菌、梭菌科、脱卤杆菌科。上述分析提示模型组与疏肝理脾高剂量组大鼠肠道菌群丰度存在明显差异。

图7 模型组（A）和疏肝理脾高剂量组（B）大鼠粪便差异菌进化分支图

2.6 肠道菌群构成变化 采用热图分析对肠道菌群构成变化进行研究。选取总丰度排名前30的OTU绘制进化关系树图，同时结合OTU在各个分组的绝对丰度进行热图可视化展示。（见图8）

图8 系统发育进化树及组间丰度分布热图

图8显示了不同菌群在不同部位的聚集情况。模型组与疏肝理脾高剂量组的OTU聚类更加直观地表现了正常对照组肠道菌群结构变化：（1）毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普氏菌科（Prevotellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、韦荣氏菌科（Veillonellaceae）为模型组大鼠肠道菌群的优势菌，在疏肝理脾高剂量组丰度下降；（2）梭菌科（Clostridaceae）、厚壁菌门（Peptostreptococcaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、S24-7、Erysipelotrichaceae为疏肝理脾高剂量组大鼠肠道菌群的优势菌，在模型组丰度下降，拟杆菌科、梭菌科为大肠中的优势菌在模型组丰度明显降低；（3）S24-7、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、梭菌科（Clostridaceae）、Erysipelotrichaceae在结肠和粪便中丰度较多且相似，但在模型组已经分散开来；（4）毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普氏菌科（Prevotellaceae）在模型组丰度明显高于疏肝理脾高剂量组。

3 讨 论

NAFLD已经成为影响全球近三分之一成年人的全球公共卫生问题。目前我国大陆地区NAFLD患病率为29.81%[10]，其中NASH占10%～20%，NASH患者10～15年内肝硬化发生率高达15%～25%，而美国近10年因NASH进展接受肝移植登记累计增加97%[11-12]。然而，目前针对NAFLD防治，欧美指南推荐胰岛素增敏剂，抗氧化剂E，以及他汀类药物、贝特类药物等，其多以改善NASH某一方面代谢性障碍症状为主，存在不能明显改善肝脏脂质沉积及炎症反应等缺陷，若出现合并其他疾病时需要联合用药，加大了不良反应和副作用发生率[13-14]。因此研究有效阻断NAFLD向NASH进展，探索NAFLD早期防治方法，具有十分重要的意义。

中医学一般将NASH归属于“痞病”“肥胖病”等范畴，肝郁、脾虚、痰瘀为其基本病机，治疗上多数采取疏肝、健脾、祛湿等治疗方法[15-16]。病因上早期多见肝郁气滞伴脾气虚，脾虚益甚，日久肝脾肾俱虚，但无论是肝郁还是肾虚，都与脾密切相关，中医强调肝、脾的关联性及相互依赖、相互影响作用。如《素问·痹论篇》云：“饮食自倍，肠胃乃伤。”缪希雍于《本草经疏》云：“饮啖过度，好食油面猪脂，浓厚胶固，以至脾气不利，壅滞为患，皆痰所为”。《温热经纬》谓：“过逸则脾滞，脾气滞而少健运，则饮停湿聚矣”。饮食不节，劳逸失度，情志失调等所致脂肪肝，皆以脾虚为病理基础，脾气亏损贯穿并影响疾病的全过程。“肝病实脾”理论来源《金匮要略》：“夫治未病者，见肝之病，知肝传脾，当先实脾，四季脾旺不受邪，即勿补之。”肝属木，脾属土，它们在生理上互相依赖，病理上互相影响，肝病最易传脾，故强调在治肝的同时，先调补脾气，使脾脏正气充实不受邪侵。故从中医理论认识NASH，脾虚是其主要病机之一，健脾是NASH的一个重要治则。

以“肝病实脾”理论为指导的代表方疏肝理脾汤是我院治疗慢性肝病经典复方。疏肝理脾汤源于疏肝健脾名方柴芍六君子汤，由柴胡、茯苓、白芍、白术、砂仁、甘草等组成。方中柴胡疏肝行气为君药；茯苓健脾利湿，白芍养血柔肝为臣药；白术健脾燥湿，砂仁温中化湿，健脾消食为佐药；甘草调和诸药为使药，共奏疏肝健脾之功效。我院多年临床应用表明，其在改善各类慢性肝病炎症和纤维化方面，尤其伴有腹胀、腹泻、大便不调等脾虚症状临床疗效显著。

“肠-肝轴”理论的提出发展了NAFLD的“多重打击”学说，肠道菌群丰度被破坏，肠黏膜屏障功能稳定性失衡，通透性增高，肠源性细菌/脂多糖（LPS）易位到肠外脏器，触发NAFLD患者肝脏炎症和肝损伤效应，以及肠道微生物群通过改变肠道菌群数量、比例和菌种性质，可影响机体正常生理活动[17-19]。故重建肠道菌群稳态成为当前阻止NASH持续进展的研究新热点。肠道菌群与NASH关联性研究实验证实，NASH大鼠及患者肠道拟杆菌门降低，厚壁菌门降低，变形菌门、肠杆菌科增加，充分说明肠道菌群与NASH存在多途径、多靶点密切关联[20-22]。基于此，在中医“肝病实脾”理论指导下，本课题组采用疏肝健脾法配伍的疏肝理脾汤干预NASH大鼠。研究发现疏肝理脾汤可通过上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表达，下调TLR4从而达到调节脂质代谢，改善肠黏膜组织紧密连接，降低炎性因子表达等的作用[23]。

本研究通过16S rRNA高通量焦磷酸测序法对肠道微生物群落菌种组成、丰度、多样性，以及菌群结构的差异特征进行特异性分析。结果发现疏肝理脾汤能明显提高NASH大鼠肠道菌群中梭菌科、拟杆菌科比例，降低普氏菌科、毛螺菌科比例，表明疏肝理脾汤可通过调节肠道菌群构成比影响肠道菌群属水平，恢复肠道微生态环境平衡。下一步我们将基于肠道微生物稳态性结合代谢组学技术寻找出关键差异性代谢产物及可能关联的关键代谢信号通路，为后期研究提供新靶点。