桔梗总皂苷对反流性食管炎大鼠食管黏膜损伤的修复作用及对TLR4/NF-κB通路的影响*

李有连，张秉丽，霍成英

（青海仁济医院，青海 西宁 810021）

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）指胃、十二指肠内容物反流至食管引起的食管炎性病变，典型症状为烧心、反酸和胸痛，严重者可出现食管黏膜糜烂出血及瘢痕形成，造成永久性损伤[1-2]。虽然亚洲人群RE发生率低于欧美国家，但近年来呈逐年上升趋势[3]。质子泵抑制剂、促胃动力药和抗抑郁药是临床常用的抗RE药物，其中质子泵抑制剂在抑制胃酸分泌和减轻RE患者的疼痛方面最有效，但仍有20%～30%的患者使用后无明显效果[4]。另外，质子泵抑制剂不能完全治愈RE，长期使用质子泵抑制剂还可能诱发严重不良反应，寻找新的治疗RE的药物和方法具有重要意义[5]。桔梗为临床常用中药，具有止咳祛痰、宣肺、排脓等作用，桔梗总皂苷为桔梗主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等药理作用[6]。研究表明，含有桔梗的中药方剂如桔梗枳壳汤、桔梗汤等对RE具有较好的治疗作用，而桔梗治疗RE的作用机制尚不清楚[7-8]。本研究拟探讨中药桔梗的主要活性成分桔梗总皂苷对RE大鼠的治疗作用并探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物6周龄SPF级健康SD大鼠75只，体质量180～220 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，饲养条件为室温（22±2）℃，湿度（50±10）%，每天定时换气，保持12 h∶12 h光暗照明，食水不限。研究方案获医学实验动物管理委员会批准，伦理审批号：QHRJ20200503。

1.2 药物与试剂 桔梗总皂苷（西安冠宇生物技术有限公司，纯度：80.75%，批号：20180127）；兰索拉唑（江苏康缘药业股份有限公司，批号：190504）；莫沙必利（江苏豪森药业股份有限公司，批号：170107）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（批号：E-EL-R2856c）、白细胞介素-6（IL-6）试剂盒ELISA（批号：E-EL-R0896c）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA试剂盒（批号：E-BC-K022-M）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA试剂盒（批号：E-EL-0060c）均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit（美国Thermo Scientific，批号：K1622）；Toll样受体4（tolllike receptor 4，TLR4）兔源单克隆抗体（批号：66350-1-Ig）、髓样分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）兔源单克隆抗体（批号：23230-1-AP）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）p65兔源单克隆抗体（批号：66535-1-Ig）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 主要仪器IX53显微镜（日本奥林巴斯）；Multiskan MK3酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；7500型定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.4 分组与造模75只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、西药组（兰索拉唑+莫沙必利）、桔梗总皂苷高剂量组、桔梗总皂苷低剂量组，每组15只。除正常对照组外，其余各组大鼠均建立RE模型，造模方法参考文献[9]，大鼠造模前1天禁食不禁水，腹部正中区域备皮、消毒、打开腹腔，幽门和十二指肠交界处使用幽门夹结扎至直径4.2 mm，并用2-0线结扎2/3胃底，检查大鼠胃和十二指肠部位无出血后，向腹腔注射5%甲硝唑1 mL和2万IU庆大霉素，用3-0线缝合腹部切口。正常对照组大鼠不造模，仅在开腹后将胃及十二指肠等组织置于腹腔外5 min后关腹，术后禁食24 h。若HE病理切片检测显示大鼠食管黏膜层充血、溃疡和糜烂，有大量炎症细胞浸润，上皮细胞有坏死和增生现象，则表明RE模型建立成功。

1.5 实验给药 造模后第3天给药，西药组和桔梗总皂苷高、低剂量组大鼠的给药剂量经课题组前期研究确定[10]，西药组大鼠灌胃兰索拉唑（10 mg/kg）和莫沙必利（2 mg/kg）溶液，桔梗总皂苷高、低剂量组大鼠灌胃100、50 mg/kg桔梗总皂苷溶液，正常对照组和模型组大鼠灌胃等量生理盐水，1次/d，连续14 d。记录大鼠术前及治疗结束后的体质量、存活率。

1.6 观察指标

1.6.1 HE染色观察食管黏膜病理变化 末次给药后2 h，将大鼠麻醉后处死，收集食管组织，4%多聚甲醛固定，蒸馏水清洗，脱水、透明后制作石蜡切片（厚度为4 μm），脱蜡、复水后行HE染色观察食管黏膜病理变化，病理分级参考《RE诊断及治疗指南》[11]进行评定，反流性食管炎病理分级见表1，正常计为0分，轻度计为1分，中度计为2分，重度计为3分。（见表1）

表1 反流性食管炎病理分级

1.6.2 TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力 剥取大鼠食管黏膜组织，加入预冷PBS缓冲液，冰上匀浆，10000 r/min离心10 min取上清，根据ELISA试剂盒说明书步骤检测食管黏膜组织TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力。

1.6.3 Western blotting检测TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表达水平 剥取大鼠食管黏膜组织，冰上研磨匀浆，加入裂解液提取组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入loading buffer混匀后煮沸5 min使蛋白变性。配置15%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入不同的一抗稀释液，稀释比例均为1∶1 000，4℃过夜，TBST清洗后将PVDF膜放入二抗稀释液（1∶1 000）中，37℃孵育2 h洗膜，滴加发光液，置凝胶成像系统显影。

1.6.4 RT-PCR检测TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达水平 剥取大鼠食管黏膜组织，冰上研磨，提取总RNA，使用RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒合成cDNA，作为荧光定量模版。引物由日本Takara公司设计合成，所有样品均以GAPDH为内参。反应体系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物分别1 μL，加去离子水至总体积25 μL。反应条件为：95℃5 min，95℃30 s，62℃30 s，72℃30 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min，4℃5 min终止反应，实验重复3次。采用2-△△CT的方法计算目的基因mRNA相对表达水平的变化。引物序列见表2。

表2 基因的引物序列

1.7 统计学方法 应用SPSS 25.0统计软件，实验指标的检测均重复3次，计量资料以“均数±标准差”（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 体质量及一般情况比较 造模前，各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗结束后，模型组、西药组、桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠体质量均低于正常对照组（P＜0.05）。与正常对照组比较，模型组大鼠精神状态差，毛发凌乱无光泽，活动和饮食减少，口周反流黄色黏液。与模型组比较，西药组、桔梗总皂苷高剂量组大鼠体质量增加（P＜0.05），精神状态好，毛发略疏松，无反流黏液。西药组大鼠体质量与桔梗总皂苷高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组大鼠体质量均高于桔梗总皂苷低剂量组（P＜0.05）。正常对照组、模型组、西药组、桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠存活率分别为100%（15/15）、73.33%（11/15）、86.67%（13/15）、93.33%（14/15）、80.00%（12/15）。（见图1）

图1 各组大鼠体质量比较

2.2 各组大鼠食管黏膜病理变化比较 正常对照组大鼠食管黏膜正常。模型组大鼠食管黏膜上皮细胞可见大量炎症细胞浸润，部分食管黏膜上皮细胞坏死、增生，黏膜糜烂，溃疡区域有肉芽组织和纤维化形成，病理学评分高于正常对照组（P＜0.05）。与模型组比较，西药组、桔梗总皂苷高剂量组、桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜损伤明显改善，炎症细胞浸润减轻，病理学评分降低（P＜0.05）。西药组和桔梗总皂苷高剂量组大鼠食管黏膜部分区域呈现上皮增生，无明显溃疡和坏死区域，两组病理学评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜组织偶见溃疡、糜烂和细胞坏死，病理学评分高于西药组和桔梗总皂苷高剂量组（P＜0.05）。（见图2、表3）

图2 各组大鼠食管黏膜组织病理变化比较（HE，×400）

表3 各组大鼠食管黏膜组织病理分级和评分比较

2.3 各组大鼠食管黏膜组织TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比较 与正常对照组比较，模型组、西药组、桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜组织SOD活力均降低（P＜0.05），TNF-α、IL-6、MDA含量均升高（P＜0.05）。与模型组比较，西药组、桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜组织SOD活力均升高（P＜0.05），TNF-α、IL-6、MDA含量均降低（P＜0.05）。与西药组比较，桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜组织SOD活力均升高（P＜0.05），MDA含量均降低（P＜0.05），而TNF-α、IL-6含量与西药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），其中桔梗总皂苷高剂量组的作用优于桔梗总皂苷低剂量组（P＜0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠食管黏膜组织TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比较）

表4 各组大鼠食管黏膜组织TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比较）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与西药组比较，cP＜0.05；与桔梗总皂苷高剂量组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只）TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）正常对照组 15 92.02±6.33 62.21±6.12 1.19±0.31 13.88±0.65模型组 11 251.36±10.12a 209.74±11.54a 2.98±0.40a 8.12±0.54a西药组 13 160.22±9.57ab 139.97±7.97ab 2.21±0.28ab 8.88±0.72ab桔梗总皂苷高剂量组14 162.35±9.65ab 138.96±6.24ab 1.55±0.22abc 10.95±0.68abc桔梗总皂苷低剂量组12 190.25±11.96abcd 161.34±9.88abcd 1.84±0.35abcd 9.34±0.73abcd

2.4 各组大鼠食管黏膜组织TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达比较 模型组、西药组、桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜组织TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白相对表达量均高于正常对照组（P＜0.05）。西药组、桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜组织TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白相对表达量均低于模型组（P＜0.05）。桔梗总皂苷高剂量组大鼠食管黏膜组织TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相对表达量均低于西药组和桔梗总皂苷低剂量组（P＜0.05）。（见图3～4）

图3 各组大鼠食管黏膜组织TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达Western blotting图

图4 各组大鼠食管黏膜组织TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表达情况（）

2.5 各组大鼠食管黏膜组织TLR4/NF-κB信号通路mRNA表达比较 模型组、西药组、桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜组织TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相对表达量均高于正常对照组（P＜0.05）。西药组、桔梗总皂苷高剂量组和桔梗总皂苷低剂量组大鼠食管黏膜组织TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相对表达量均低于模型组（P＜0.05）。桔梗总皂苷高剂量组大鼠食管黏膜组织TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相对表达量均低于西药组和桔梗总皂苷低剂量组（P＜0.05）。（见图5）

图5 各组大鼠食管黏膜组织TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相对表达量比较（x±s）

3 讨 论

RE是临床多发的消化系统常见疾病，虽然多数患者经质子泵抑制剂等抑酸药治疗后病情得到显著改善，但仍有部分患者疗效较差，病情易反复，且长期使用质子泵抑制剂仍存在较多的不良反应，寻找和开发新的治疗药物具有重要意义[12-13]。桔梗是桔梗科植物桔梗的干燥根，治疗食管炎具有较好的临床疗效，其作用机制值得进一步阐明[14]。桔梗中含有皂苷、黄酮、多糖等活性成分，皂苷被认为是桔梗的特征性成分和主要活性成分[15]。本研究探讨了桔梗总皂苷对RE大鼠的治疗作用及其作用机制。

本研究显示，RE模型大鼠体质量降低，生存质量下降，食管黏膜上皮层细胞有坏死和增生，部分组织呈纤维化状态，炎症细胞浸润明显，病理学评分显著增加。桔梗总皂苷干预后，大鼠体质量增加，食管黏膜损伤得到明显改善，病理学评分低于模型组，表明桔梗总皂苷对RE食管黏膜损伤具有保护和修复作用。SOD是一种重要的抗氧化酶，SOD的水平可反映机体清除自由基的能力；MDA则与组织细胞受损程度相关，是氧自由基损伤组织细胞后产生的脂质过氧化物[16]。研究表明，食管黏膜损伤与局部氧自由基生成过多有关，应用抗氧化剂可以预防和治疗RE[9]。本研究结果表明，桔梗总皂苷可提高RE大鼠食管黏膜组织SOD活力，降低MDA含量，高剂量与低剂量桔梗总皂苷抗氧化应激作用优于西药，表明一定剂量的桔梗总皂苷能抑制RE造成的食管黏膜组织氧化应激损伤，也可能表明反流性食管炎的治疗应当联合外源性抗氧化剂，而不是仅使用抑酸药和促胃动力药。TNF-α是炎症趋化和激活因子，其含量与炎症活动呈正相关。IL-6是由活化的T细胞、B细胞、成纤维细胞产生的多效应细胞因子，具有广泛的促炎作用[17]。本研究结果表明，桔梗总皂苷可降低RE大鼠食管黏膜组织TNF-α和IL-6含量，表明桔梗总皂苷能抑制反流性食管炎相关炎症反应。TLR4是一种细胞膜表面受体，通过识别病原体细胞壁的保守成分诱发机体炎症免疫反应。MyD88是Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）家族下游炎症通路的经典分子。MyD88可通过TLRs家族成员激活NF-κB信号通路，介导炎症和氧化应激反应等病理过程[18-19]。研究表明，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路可抑制炎症、氧化应激反应和细胞凋亡[20-21]。本研究结果表明，模型组大鼠食管黏膜组织TLR4、MyD88和NF-κB p65表达水平高于正常对照组，桔梗总皂苷干预后，TLR4、MyD88和NF-κB p65表达水平降低，表明桔梗总皂苷可抑制RE大鼠食管黏膜TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。

综上所述，桔梗总皂苷可减轻RE大鼠食管黏膜损伤，促进组织修复，减轻炎症和氧化应激反应，其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活化有关。