石榴籽油对骨性关节炎大鼠膝关节病理形态及相关细胞因子mRNA水平的影响研究*

刘雄伟，张 涛，邵 国，马志朋，王睿甲，许文胜

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古科技大学包头医学院第三附属医院；3.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院关节一科)

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种表现为关节疼痛和退行性病变的疾病，主要特征为软骨退变、周围骨重塑和多种关节组织发生病理变化[1]。关节软骨是一种薄的结缔组织，覆盖于关节中长骨的承重表层，其独特的基质组成在关节运动中提供了几乎光滑的表面。软骨细胞是软骨中单一存在的细胞，利用基质的合成和分解来维持软骨基质的稳态均衡。OA的病因和发病机制复杂，通常与年龄、炎症、创伤、代谢紊乱、肥胖、遗传等因素有关，目前比较一致的观点是本病与滑膜炎性反应及软骨代谢水平异常密切相关[2]。

石榴籽油(pomegranate seed oil，PSO)是植物来源的Omega-3多不饱和脂肪酸(n-3Polyunsaturated fatty acid，n-3PUFAs)，其主要成分为石榴酸，约占86.0 %以上，其化学组成是十八碳三烯酸(C18：3n-5，cis-9，trans-11，cis-13)，化学结构式如图1所示。因PSO具有抗氧化、清除自由基、抗衰老和类雌激素等多种药理学功效[3]，推测PSO在OA炎症过程中会起到一定影响作用。

图1 石榴酸化学结构式

OA的病理改变过程中，存在于关节软骨细胞中的一些细胞因子、基质金属蛋白酶起着比较重要的影响作用，比如，MMP-1、CoⅡ都是非常重要的影响因子。因此，针对以上细胞因子设计了如下实验：通过RT-PCR从mRNA水平对以上目的基因进行检测分析，通过不同干预剂量探究石榴籽油对骨性关节炎病理变化的作用机制。

1 对象与方法

1.1实验动物 8周龄健康雌性SD大鼠100只，购自内蒙古科技大学包头医学院动物实验中心，许可证号码SCXK(苏)：2016-0010。将实验动物分成5个组，假手术组(Control)、模型对照组(简称模型组，Model)、实验1、2、3组(Experiment1、2、3)。每组各20只。

1.2研究方法

1.2.1手术OA建模 除假手术组实施假手术外，其余4个组均通过改良Hulth法建立OA动物模型，即在经典Hulth法基础上剪断前后交叉韧带和内侧副韧带，切除内侧半月板，滴入少量青霉素溶液，缝合关节囊和皮肤。驱赶4周后确认建模成功的情况下，挑选符合条件的动物进入实验组，实验组分为低剂量组(实验1组)、中剂量组(实验2组)和高剂量组(实验3组)，每组20只。按照魏伟等[4]编著的《药理实用方法学》第4版中绍的方法，等效剂量人鼠换算系数为6.3，得出中剂量参考标准为1.27 g/kg，剂量递增标准0.32 g/kg，从而确定了PSO的灌胃剂量标准。全部5个组动物除喂食普通饲料外，给予假手术组和模型对照组动物1.5 g/(kg·d)生理盐水灌胃，实验组3组动物分别给予0.95 g/kg、1.27 g/kg和1.59 g/kg纯石榴籽油灌胃，各组大鼠均在相同条件下喂养，自由饮水和进食，每7 d称重一次，以调整PSO灌胃剂量。继续喂养12周，麻醉致死后再称重一次，剪开膝关节至股骨处皮肤，再剪断交叉韧带暴露出髁软骨，将软组织去除后，切取股骨远端临近膝关节部分用10.0 %中性甲醛溶液固定后备检。

1.2.2检测方式 (1)Micro CT检测分析膝关节BV/TV(%)、SMI骨结构参数；(2)RT-PCR检测软骨细胞CoⅡ、MMP-1 mRNA表达。

2 结果

2.15个组动物膝关节Micro CT检测以及骨参数数据分析 (1)大鼠膝关节Micro CT检测。与假手术组相比，模型对照组与3个实验组中，大鼠膝关节软骨下骨的骨小梁发生了不同程度的数目减少，密度降低，存在明显骨量丢失，有骨质疏松发生。见图2。(2)大鼠膝关节骨体积分数[BV/TV(%)]。体积分数指所选区域内骨小梁总体积与样本总体积之比。与假手术组比较，模型组和实验1、2、3组均减小(P<0.05)；与模型组比较，实验1、2、3组增加(P<0.05)；实验1、2、3组数值组间两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。(3)结构模型指数(SMI)。SMI反映骨小梁板状结构或棒状结构特征，理想板状结构的数值为0，理想棒状结构的数值为3，骨质疏松发生时，骨小梁从板状结构转变向棒状结构，SMI数值变大。与假手术组比较，模型组和实验1、2、3组均增加(P<0.05)；与模型组比较，实验1、2、3组减小(P<0.05)；实验1、2、3组数值组间两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图2 5个组动物膝关节Micro CT图

表1 5组动物膝关节Micro CT关节骨参数数据

2.25组动物膝关节软骨细胞目的基因mRNA表达 采用RT-PCR法，以GAPDH为内参，对MMP-1、CoⅡ因子mRNA进行检测。引物序列如下，见表2。

表2 目的基因和GAPDH引物序列

(1)MMP-1 mRNA表达结果(图3)：与假手术组比较模型对照组表达量增加(P<0.01)；实验1、2、3组与模型对照组比较，表达量减少(P<0.01)；实验1、2、3组表达量两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)CoⅡ mRNA表达结果(图4)：与假手术组比较模型对照组表达量降低(P<0.01)；与模型对照组比较，实验1、2、3组相对表达量增加(P<0.01)；实验1、2、3组表达量两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 MMP-1 mRNA表达结果

图4 CoⅡmRNA表达结果

3 讨论

微计算机断层扫描技术(Micro CT)是近年来运用到实验动物中的新型研究方式，是一种无损伤性的三维(3D)成像技术，可以在实验材料完整的状态下清楚认识样本内部的显微结构[5]，极大提高了实验的可靠性。本次实验结果显示，与假手术组比较，模型对照组BV/TV(%)减小、SMI增加。与模型组比较，实验1、2、3组BV/TV(%)增加，SMI减小，说明手术建模后大鼠膝关节骨质发生了OA病理改变，骨小梁总体积减小，骨小梁从板状结构转变向棒状结构加快，骨量流失，骨质疏松发生，而PSO可以改善此病理变化。

在生理条件下，软骨基质中胶原的合成和降解维持着动态平衡[6]。在骨性关节炎软骨中，软骨基质的变性和溶解速率大于合成速率，能直接降解CoⅡ的MMP-1数量增加，使CoⅡ的数量减少,导致软骨退变[7]。本次实验RT-PCR结果显示：与假手术组比较，模型对照组MMP-1 mRNA相对表达量增加，CoⅡ mRNA表达量减小，与模型组比较，实验1、2、3组MMP-1 mRNA相对表达量减小，CoⅡ mRNA表达量增加，表明术后关节软骨细胞基质平衡被打破，基质溶解速度加快，软骨发生退变，而PSO可以有效抑制CoⅡ降解，促进软骨基质代谢平衡，使关节软骨弹性恢复起到保护软骨作用。

从实验结果分析看出，PSO从低到高剂量改善软骨细胞MMP-1、CoⅡ mRNA表达量与干预剂量呈非正相关，这可能与在一定浓度范围内当有效剂量达到峰值后，继续增加干预量并不能进一步影响相关细胞因子mRNA表达有关。

综上所述，PSO具有改善OA大鼠膝关节软骨退变及保护关节软骨作用的机制可能为：(1)通过上调BV/TV(%)恢复骨体积，降低SMI抑制骨小梁从板状结构转变向棒状结构；(2)通过下调关节软骨细胞MMP-1 mRNA表达量，抑制软骨基质降解酶的活性，减缓关节软骨基质分解；(3)通过上调胶原蛋白CoⅡ的mRNA表达量，促进软骨恢复弹性，改善软骨退变。