岳阳汉族人群血小板抗原基因多态性研究

苏湘晖,孙 昂,谭 涛,向雅香,孔维臣

(1.岳阳市中心血站，湖南 岳阳414000;2.长春博德生物技术有限责任公司)

人类血小板抗原(human platelet antigen,HPA)是位于血小板膜糖蛋白上、由血小板特有的抗原决定簇组成，表现血小板独特的遗传多态性，研究已发现HPA多态性分布与不同人种和地域有关[1]。因此，了解不同地域人群HPA多态性分布，对指导临床精准输注血小板、避免血小板输注无效具有重要意义。我们采用聚合酶链反应核苷酸特异性引物技术(PCR-SSP)方法，研究了岳阳地区374名血小板固定捐献志愿者血小板抗原HPA-1-6,15,21系统基因多态性特点。

1 材料与方法

1.1 研究对象岳阳市中心血站血小板固定捐献志愿者374名，每年捐献血小板3次以上，籍贯岳阳地区，均为汉族，男性215名、女性159名，年龄18-50岁，签署知情同意书和应急捐血同意书，留取EDTA抗凝全血5 ml/人。

1.2 试剂与仪器人类血小板同种抗原HPA1-6,15,21基因分型试剂盒(P20191009，天津基诺泰普公司)，DNA提取试剂盒(R6903,北京天根生化公司)，PCR仪(GeneAmp 9700，美国ABI公司)，凝胶电泳仪(JY300C，北京君意东方电泳设备有限公司)，紫外分析仪(JYO2S，北京君意东方电泳设备有限公司)。

1.3 DNA提取取0.3 ml EDTA抗凝全血，按DNA提取试剂盒操作说明书操作，DNA浓度30-80 ng/μl，纯度A260/A280比值=1.6-1.8。

1.4 HPA基因分型应用HPA1-6,15,21基因分型试剂盒，采用PCR-SSP方法对8个抗原系统16个等位基因进行基因分型，操作按试剂和仪器说明书进行。PCR扩增条件为：96℃ 3 min；96℃ 25 s，68℃ 45 s，72℃ 30 s,5个循环；96℃ 25 s，61℃ 45 s，72℃ 30 s,22个循环；96℃、20 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s,8个循环；72℃延伸3 min，降温至4℃保存。将PCR反应产物8 μl转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中，140-150V电泳10-15 min(内参质控带与阳性分型带清晰分开时即停止电泳)，紫外凝胶成像系统下观察结果并拍摄成像，保存试验结果。对照孔物引位图判读基因分型结果。

1.5 统计学分析直接计算等位基因频率和表型频率。HPA抗原不配合率采用公式P=2ab(1-ab)计算(a，b为等位基因频率)，并进行Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验[2]。不同地区人群HPA-1-6,15,21基因频率差异采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 岳阳地区汉族人群HPA-1-6,15,21基因分型结果374名血小板固定捐献志愿者HPA-1-6,15,21基因分型电泳图见图1，同时检测到a,b等位基因，各等位基因频率分别为1a 0.9880、1b 0.0120、2a 0.9599、2b 0.0401、3a 0.6043、3b 0.3957、4a 0.9987、4b 0.0013、5a 0.9947、5b 0.0053、6a 0.9866、6b 0.0134、15a 0.4479、15b 0.5521、21a 0.9933、21b 0.0067。各等位基因不配合率从高到底分别为HPA-15：0.3723、HPA-3：0.3639、HPA-2：0.0740、HPA-6：0.0261、HPA-1：0.0.0234、HPA-21：0.0132、HPA-5：0.0105、HPA-4：0.0026。Hardy-Weinberg平衡检验，HPA-1-6,15,21的P>0.05，符合H-W平衡，结果见表1。

图1 岳阳地区汉族人群HPA1-6,15,21基因分型电泳图

表1 岳阳地区汉族人群血小板固定捐献志愿者HPA1-6,15,21基因型和等位基因频率分布

2.2 岳阳地区汉族人群HPA-1-6,15,21基因分布与不同地区汉族人群比较岳阳地区汉族人群HPA-1-6,15,21基因分布与石家庄汉族人群[3-4]、南京汉族人群[5]、广州人群[6-7]、南昌人群[8]、吉林汉族人群[9]、河南汉族人群[10]、山东汉族人群[11]、长沙汉族人群[12]、黑龙江汉族人群[13]比较，HPA-2基因分布与南京人群(χ2=5.5720，P=0.0183)和广州人群(χ2=21.6100，P<0.0001)有差异；HPA-3基因分布与石家庄人群有差异(χ2=8.7480，P=0.0031)；HPA-5基因分布与南京人群(χ2=5.1760，P=0.0229)和黑龙江人群(χ2=5.7300，P<0.0167)有差异；HPA-15基因分布差异最大，与石家庄人群(χ2=9.2220，P=0.0024)、广州人群(χ2=8.8610，P=0.0029)、南昌人群(χ2=5.7900，P=0.0161)、吉林人群(χ2=4.6890，P=0.0304)、山东人群(χ2=10.7200，P=0.0011)、长沙人群(χ2=6.9580，P=0.0083)均存在差异。HPA-1、HPA-4、HPA-6、HPA-21基因分布与其他地区人群比较无统计学差异。见表2。

表2 岳阳地区汉族人群HPA-1-6,15,21等位基因分布频率与不同地区人群比较

3 讨论

近年来，随着输血技术研究的深入，成分输血得到了大力推广和应用，机采血小板已成为治疗各种因血小板减少和功能障碍引起出血性疾病的重要血液成分。但是由于HPA遗传多态性，HPA基因分布在不同种族、不同地区的人群中分布存在差异性，在临床血小板随机输注中，HPA抗原引起同种免疫的风险表现出一定的地域特征，在再次或多次输注血小板时易发生血小板输注无效、输血后紫癜、新生儿同种免疫学血小板减少性紫癜等疾病[14]。因此，了解一个地区人群HPA基因多态性分布特点，对指导临床精准输注血小板具有重要意义。本研究采用PCR-SSP方法对岳阳地区374名血小板固定捐献志愿者HPA-1-6,15,21基因分型并进行基因多态性研究，初步掌握了本地区HPA基因多态性及分布特征，HPA-3、HPA-15系统基因表现型ab频率高于aa，HPA-1、HPA-2、HPA-4、HPA-5、HPA-6、HPA-21系统基因表现型，以aa为主，HPA-15、HPA-3不配合率最高，在临床血小板输注中应特别重视。而对于研究较少的HPA-21系统，HPA-21b基因频率为0.67%，随机输血其不配合率为0.0132，在临床血小板输注中也不能忽视。H-W平衡检验发现，HPA-1-6,15,21基因分布符合H-W平衡规律。岳阳地区人群HPA-1-6,15,21基因多态性与国内其他地区人群比较，HPA-2、HPA-3、HPA-5、HPA-15基因分布存在统计学差异，具有本地区多态性分布特点，这与岳阳自古水陆交通便利、人口迁徙较大的遗传背景有关。

目前，临床血小板输注为随机输注，大多未进行HPA基因检测，HPA基因多态性特点易产生血小板同种抗体，再次或多次输血后易发生输血不良反应。随着输血技术的发展，如何使临床精准输血、最大限度的避免免疫性输血不良反应，从而达到科学合理、效果更好是输血技术研究的重要方向[15]。对固定献血者检测HPA系统基因、建立献血者HPA基因信息库，对配合型血小板输注具有重要临床意义。本研究初步建立了岳阳地区血小板志愿捐献者HPA基因信息库，对保证本地区血小板的精准输注发挥了重要作用。