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饲料投喂、饥饿与活饵再投喂对鳜幼鱼糖代谢的影响

2021-11-23马晨夕赵金良曾萌冬宋银都周云红

水产科学 2021年6期
关键词:幼鱼糖原激酶

马晨夕,赵金良,曾萌冬,宋银都,周云红

( 上海海洋大学,农业农村部淡水水产种质资源重点实验室,水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心,水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306 )

糖代谢是动物体内的重要生理代谢过程,糖可为机体生长代谢提供所需能源和碳源,满足机体生命活动的基本需求。糖代谢主要包括糖异生、糖酵解、戊糖磷酸等代谢途径,鱼类糖代谢基本过程与哺乳动物相似。在机体内糖原是葡萄糖的储存形式,在血液中的运输形式是葡萄糖,血糖水平可反映机体内糖代谢状况[1]。血糖水平主要受胰岛素和胰高血糖素的调节[2]。对于养殖鱼类,饲料中淀粉是体外糖的主要来源,摄入后经淀粉酶消化成单糖,吸收后经血液运输到各组织中进行合成代谢和分解代谢。研究表明,鱼类对糖的利用能力较低,表现在高血糖的不耐受性和低血糖的耐受性[3],肉食性鱼类对碳水化合物利用能力更低,与草食性和杂食性鱼类相比,当摄入葡萄糖后,肉食性鱼类的糖酵解效能弱而糖异生效能强是糖利用率低的主要原因[4]。尽管如此,鱼体内仍有完善的葡萄糖感知、吸收与代谢调控机制[5]。

鳜鱼(Sinipercachuatsi)为肉食性养殖鱼类,养殖时主要投喂活鱼饵。鱼苗阶段,当饵料鱼供应不足时,鳜鱼苗表现为耐饥饿能力差,常会发生自相残杀,影响鱼苗产量[10],饥饿状态下,鱼类糖代谢会发生变化。另一方面,为摆脱鳜鱼养殖对活鱼饵的严重依赖,20世纪80年代后期起,国内学者开展了大量的饲料驯化和配合饲料中营养需求研究[11-12]。目前认为,鳜鱼对蛋白质的需求量很高,能耐受较高的脂肪水平,而对碳水化合物的利用较差[13-14],但碳水化合物对鱼类生长是必不可少的。笔者对鳜幼鱼进行了人工饲料投喂、饥饿与活饵再投喂处理,分析对其肝体指数、肝肌糖原含量和血糖浓度、激素含量及代谢酶活性的影响,探究不同营养水平下鳜幼鱼糖代谢的变化,以期为鳜幼鱼营养生理学提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鳜幼鱼购自湖州市某家庭农场,于上海海洋大学新场养殖基地室内水泥池中暂养。取鳜幼鱼600尾,平均体长(44±1.02) mm,平均体质量(1.94±0.15) g,进行饲料驯化,采用“活饵→活饵加死饵→死饵加冰鲜饵→冰鲜加软颗粒饲料→软颗粒饲料”方式逐步过渡驯化,驯化从2019年6月1日开始,驯化时间为17 d,直至鳜幼鱼完全摄食饲料;另取鳜幼鱼300尾,平均体长(43±1.36) mm,平均体质量(1.89±0.12) g,采用活鱼饵投喂。饲料投喂、饥饿与活饵再投喂与饲料驯化的试验环境一致,水深2.0 m,水温(23±0.5) ℃,溶解氧≥8.0 mg/L,pH 7.5~8.0。鳜鱼粉料购自浙江某生物科技有限公司,投喂前30 min,粉料与水按7∶3(质量比)均匀混合,挤压成粒径0.3 cm×0.7 cm的饲料。饵料鱼为鲫鱼(Carassiusauratus)苗,全长2 cm,购自上海市松江水产良种场。

1.2 试验方法

1.2.1 饲料养殖试验

自饲料驯化成功的鳜幼鱼中随机挑选45尾测量体质量,作为饲料组的初始值,平均体质量(3.27±0.63) g;自活饵投喂中挑选规格相近45尾测量体质量,作为活饵组的初始值,平均体质量(3.54±0.52) g。饲料组和活饵组各设3个平行,每个平行15尾,置于1 m×1 m×1.5 m网箱中进行养殖试验。饲料组每日表观饱食投喂2次(8:00和16:00),活饵组足量投喂活鲫鱼苗,试验周期为3周。

1.2.2 饥饿与再投喂试验

从投喂活饵的鳜幼鱼中挑选健康状况良好、规格整齐的135尾,平均初始体长(81.06±2.58) mm,平均初始体质量(8.14±1.38) g,随机分成3组:正常投喂组、饥饿组、饥饿后再投喂组,每组各设3个平行,每个平行15尾。正常投喂组连续投喂活鲫鱼苗3周,饥饿组3周内均不投饵,饥饿后再投喂组为饥饿2周、再投喂活鲫鱼苗1周,其他试验条件同上,试验周期为3周。

1.2.3 样品采集

取样前,各组试验鱼均禁食1 d,放入间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉液(400 mg/L)中完全麻醉后,擦干水分,称量体质量、测体长。每组随机取10尾,每尾断尾取血约0.1 mL,置于肝素钠处理过的离心管中,12 000 r/min(离心半径12 cm)离心5 min,取血清,置于-80 ℃保存,待测血糖浓度。随后,于冰块上迅速取肝脏和背部肌肉称量质量,置于-80 ℃下保存待测。

1.2.4 生化测定

酶活性测定:在冰水浴上取各组试验鱼肝脏,用预冷的磷酸缓冲盐溶液(0.01 mol/L,pH 7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称量0.06 g组织,剪碎,按1∶9(m/V)的比例加入磷酸缓冲盐溶液540 μL,用玻璃匀浆器在冰水浴中匀浆,匀浆混合液4 ℃、5000 r/min(离心半径12 cm)离心8 min,吸取离心上清液于(25±1) ℃条件下使用酶标仪(Synergy H1,美国伯腾仪器有限公司)在450 nm下分别测定葡萄糖激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖脱氢酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶以及胰岛素、胰高血糖素吸光度值。所用试剂购自上海酶联生物科技有限公司,具体操作步骤和试验结果计算按说明书进行。

由于吸收塔的空塔流速一般在3~4m/s,而湿电内部的电场风速为2~3m/s,所以湿电壳体的直径往往大于下部吸收塔的直径,这对湿电和吸收塔的结构设计提出了更为苛刻的要求。如不能解决结构设计问题,那么一体式湿电无疑就是“空中楼阁”。

血糖测定采用葡萄糖氧化酶法[15],肝、肌糖原的测定采用蒽酮显色法[16],所用试剂购自南京建成生物科技有限公司,具体方法按说明书操作步骤进行。

1.2.5 相关统计分析

在Excel 2019中对原始数据进行整理,运用SPSS 19.0软件对每组数据统计分析,用单因子方差分析和LSD多重比较法进行差异显著性检验,每组数据均以平均值±标准误表示,显著性水平为0.05。

RLGR/%=(Lt-L0)/L0×100%

wWGR/%=(mt-m0)/m0×100%

wLWGR/%=(mht-mh0)/mh0×100%

wLI/%=mh/m×100%

式中,RLGR为体长增长率;wWGR为体质量增加率;wLWGR为肝质量增加率;wLI为肝指数;Lt、L0分别代表试验鱼的平均终末体长、平均初始体长(mm);mt、m0分别代表试验鱼的平均终末体质量、平均初始体质量(g);mht、mh0分别代表试验鱼的平均终末肝质量、平均初始肝质量(g);t表示试验天数(d);mh、m分别代表试验鱼的肝脏质量、体质量(g)。

2 结 果

在饲料养殖试验中,经过3周投喂配合饲料和活饵对鳜幼鱼生长影响显著。活饵组与饲料组的体长、体质量、肝质量终末值与初始值相比均显著增加(P<0.05)(表1)。且活饵组体长、体质量、肝质量终末值与饲料组终末值相比均显著增加(P<0.05)。活饵组体长增长率、体质量增加率、肝质量增加率均显著高于饲料组。总体来看,饲料组生长速度显著慢于活饵组,而饲料组的肝指数显著高于活饵组(P<0.05)。

表1 饲料养殖试验鳜幼鱼各组生长指标的变化

在饥饿与再投喂试验中,与正常投喂组相比,饥饿组体长、体质量、肝质量与肝指数均显著下降(P<0.05)(表2),其中体质量显著下降57%,肝质量显著下降70.83%,肝指数显著下降;再投喂组体长、体质量、肝质量和肝指数均有恢复。

在饲料养殖试验中,饲料组、活饵组肝糖原含量和血糖浓度与各组初始值差异不显著,饲料组与活饵组肌糖原含量均显著高于各组初始值(P<0.05),饲料组肝糖原、肌糖原含量和血糖浓度与活饵组间差异不显著(表3)。饲料组葡萄糖激酶、己糖激酶活性与活饵组间未见显著差异,与其初始值差异也不显著,而饲料组磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性显著高于活饵组(P<0.05)。饲料组糖异生代谢酶磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性与活饵组间差异不显著;戊糖磷酸途径代谢酶葡萄糖脱氢酶活性与活饵组差异也不显著。饲料组与活饵组糖原合成酶、糖原磷酸化酶活性差异不显著,胰岛素含量、胰高血糖素质量浓度差异不显著,且与各初始值间无显著变化。

表2 饥饿与再投喂试验鳜幼鱼各组生长指标的变化

表3 饲料养殖试验各组糖代谢相关指标的变化比较

在饥饿与再投喂试验中,与正常投喂组相比,饥饿组肝糖原、肌糖原含量和血糖浓度均显著下降(P<0.05)(表4),其中肝糖原含量显著下降74.32%,肌糖原含量显著下降44.19%,血糖浓度也显著下降37.70%;再投喂组肝糖原含量显著恢复(P<0.05),肌糖原含量有一定水平恢复,血糖浓度基本恢复到最初水平。与正常投喂组相比,饥饿组糖酵解酶活性均有不同程度下降,其中,磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性显著性下降(P<0.05);再投喂组糖酵解各代谢酶活性无显著变化。与正常投喂组相比,饥饿组糖异生途径中磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性基本无变化,戊糖磷酸途径中葡萄糖脱氢酶活性显著下降(P<0.05);再投喂组糖异生代谢酶活性差异不显著,而戊糖磷酸途径葡萄糖脱氢酶差异显著(P<0.05)。与正常投喂组相比,饥饿组糖原合成酶活性显著下降(P<0.05),糖原磷酸化酶活性显著升高(P<0.05),胰岛素含量显著下降,胰高血糖素质量浓度显著上升;饥饿后再投喂组糖原合成酶、糖原磷酸化酶活性恢复,胰岛素含量、胰高血糖素质量浓度恢复到正常水平。

表4 饥饿与再投喂试验各组糖代谢相关指标的变化比较

3 讨 论

3.1 饲料投喂对鳜幼鱼糖代谢的影响

目前认为,鳜幼鱼配合饲料中蛋白质最适含量为44.7%~45.8%[13],脂质最适含量为7%~12%[11],本试验中所用饲料基本符合,能满足鳜幼鱼的生长需求。与活饵投喂相比,饲料投喂对鳜幼鱼生长仍有一定影响,具体表现为饲料组体长增长率、体质量增加率均显著低于活饵组,这一结果与杂交鲟(Acipenserschrenckii♀ ×A.baeri♂)仔鱼[17]和点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)幼鱼[18]饲料投喂后生长结果基本一致。分析认为,人工饲料中可能因缺乏生物活饵料中的某些微量活性物质,使蛋白酶分泌减少[19],因此,活饵投喂比饲料投喂更利于促进鱼体对食物的消化利用。由于鳜鱼饲料中各种营养物质组成含量与活饵间存在差异,因此,也在一定程度上影响鳜幼鱼摄食与生长。

对南方鲇(Silurusmeridionalis)[20]和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[21]研究发现,饲料中过多的糖可转化成糖原储存在肝脏中,导致肝指数增大。对乌鳢(Channaargus)[22]研究发现,肝指数的增大与肝脏脂肪含量有关。本试验中,饲料组与活饵组在肝糖原含量上并无显著差异,饲料组肝指数高于活饵组,可能由于饲料制作过程中某些必需营养素(如维生素)被破坏[23-24],部分营养物质的不平衡造成肝脏脂肪代谢缓慢,转运失调,导致脂肪肝形成,肝组织有一定程度增大[25]。饲料中脂肪含量高可引起鱼类脂肪肝[26],本试验中,饲料的粗脂肪含量显著高于活鱼饵,可能为饲料组肝指数高的原因。饲料中合理的营养配比不仅有利于鱼体生长,对鱼体健康也至关重要。

本试验中,活饵与饲料喂食3周,饲料组血糖浓度、糖原含量、胰岛素含量和胰高血糖素质量浓度与活饵组间均无显著差异。除饲料组糖酵解代谢酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性显著高于活饵组外,其他糖代谢途径中代谢酶活性并无显著差异。一般来说,当饲料淀粉含量增加时,在一定程度上会促进糖酵解过程,表现为糖酵解酶活性增强,以减少血液中的葡萄糖浓度,维持内稳态的平衡,这在欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)[27]和河鲈(Percafluviatilis)[28]的不同碳水化合物水平对肝糖代谢影响研究中得到证实。另有研究报道,不同的糖脂比影响糖酵解酶活性,且糖的来源[29]及鱼的种类不同时,糖酵解发生变化的关键酶亦会出现不同变化[30]。本试验中,饲料与活饵的糖脂比分别为71.25%、23.81%。在饲料喂食条件下,糖酵解磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性表现增强,推测可能为饲料与活饵中糖脂比不同引起的,且饲料的糖脂比高于活饵。

3.2 饥饿与再投喂对鳜幼鱼糖代谢的影响

当面临饥饿胁迫时,鱼类和其他动物一样,也会动用储能物质(如糖原、脂类和蛋白质)来提供能量,且鱼类更倾向优先动用脂类和蛋白质供能[31-32]。本试验中,饥饿组与正常投喂组相比,体质量、肝质量、肝指数显著下降,肝糖原含量、肌糖原含量、血糖水平也显著下降。肝脏是主要的储能场所,肝脏中贮存大量肝糖原,肝糖原可分解维持血糖水平,使鱼体在饥饿状态下维持一定的血糖浓度[33]。肝指数下降与肝糖原含量下降,说明在饥饿过程中鳜幼鱼动用了肝糖原来提供能量,这在南方鲇幼鱼[34]的糖代谢研究中也有相似结果。肌肉是体质量的主要组成部分,糖在肌肉组织中以肌糖原形式储存,在特定生理饥饿状态下,即肝糖原消耗到一定程度时,机体也会动用肌糖原协助提供能量维持生存需要[35]。本试验中,从体质量的下降程度来看,饥饿状态下除糖原分解外,鳜幼鱼体内蛋白质和脂肪也应有消耗,两者通过糖异生作用生成葡萄糖,与肝糖原分解共同维持血糖浓度。这在食蚊鱼(Gambusiaaffinis)和唐鱼(Tanichthysalbonubes)幼鱼饥饿状态下主要能量物质消耗研究[36]中有过报道。

本试验中,饥饿对鳜幼鱼胰岛素含量和胰高血糖素质量浓度影响显著。饥饿状态下,鳜幼鱼胰岛素含量显著下降,胰高血糖素质量浓度显著上升,说明鳜幼鱼体内胰岛素和胰高血糖素参与体内血糖浓度调控。饥饿状态下,胰岛素含量降低和糖原合成酶活性下降的结果证明胰岛素与它促进合成代谢的特性相适应[37-38]。胰高血糖素质量浓度升高可促进体内肝糖原的分解和非糖物质(蛋白质、脂质等)的转化来快速升高血糖。

本试验中,与正常投喂组相比,鳜幼鱼饥饿组戊糖磷酸途径中葡萄糖脱氢酶活性下降幅度最大,糖酵解途径磷酸果糖激酶次之,相比之下,糖异生途径的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性下降较小。正常生理状态下,戊糖磷酸途径可为鱼体内脂肪合成提供所需的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,当处于饥饿状态时,推测鳜幼鱼体内戊糖磷酸途径可能减弱或受到抑制,即通过抑制脂肪合成作用,减少其他代谢对葡萄糖的消耗来维持血糖浓度,满足生命活动基本需求。饥饿状态下,随着血糖浓度的持续降低,鳜幼鱼磷酸果糖激酶活性下降,表明糖酵解途径随血糖水平相应减弱。饥饿状态下尽可能减少葡萄糖的消耗维持血糖浓度,这是鱼体面对饥饿胁迫时的生理对策[39]。这也与草鱼在饥饿状态下糖酵解酶活性变化[37]相似。从肝糖原的耗竭程度来看,通过糖异生作用由非糖物质蛋白质和脂肪生成葡萄糖是提供葡萄糖能量的重要途径,磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性降低最少,表明鳜幼鱼在肝糖原显著耗竭时,糖异生作用对维持体内葡萄糖水平更为重要。

有研究表明,短期饥饿后再投喂可使鱼类机体生理功能恢复到正常水平,或出现补偿生长作用[40-41]。本试验中,鳜幼鱼饥饿再投喂后肝质量、肝指数、血糖浓度能恢复正常投喂组水平,但在体长、体质量、肝糖原、肌糖原各指标方面仍与正常投喂组有差异(P<0.05)。不同指标具有不同的恢复速度,可能与再投喂时间相对较短、葡萄糖补充量时间不足以及不同代谢过程有关。随着葡萄糖补充水平的增加,各项指标将得到相应的最大恢复,甚至会出现补偿生长。

4 结 论

本试验中,饲料组鳜幼鱼生长速度显著慢于活饵组,两组体内糖代谢途径无明显差异。饥饿与活饵再投喂对鳜幼鱼体内的糖代谢影响较为显著,具体体现在血糖、肝糖原、肌糖原、戊糖磷酸途径代谢酶葡萄糖脱氢酶、糖酵解代谢酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶、胰岛素及胰高血糖素水平变化显著,再投喂后不同指标恢复速度不同。

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