EM菌对互花米草凋落物底泥中克氏原螯虾幼苗的影响

张婧怡，姜仁平，孟祥龙，黄 成，刘茂松

( 1.南京大学 生命科学学院，江苏 南京 210023； 2.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017 )

互花米草(Spartinaalterniflora)原产于美洲大西洋西海岸以及墨西哥湾[1]，20世纪引入我国后迅速蔓延，目前已成为我国海岸滩涂湿地生态系统最主要的外来入侵植物[2]。植物群落净第一性生产力的大部分是以凋落物的形式流入土壤并进入食物链[3]。《环境再生设计》[4]一书中曾推荐“錾式犁耕作”技术，即将植物残体埋入土中，作为一项对扰动后的土壤进行恢复的有效技术。但互花米草凋落物残体大量输入土壤中，对底栖动物和湿地生态系统食物网结构均有很大影响。

为探究盐城滨海滩涂上凋落物流入土壤对底栖动物的影响，以及适当干预后的响应，设计了本次试验。前期调查发现克氏原螯虾(Procambarusclarkii)为盐城滨海滩涂淡水潮沟及两侧潮坪上常见的优势底栖动物之一[5]，该物种原本也是外来物种，但是经过多年繁育养殖，已成为我国重要的水产经济动物，故而本试验选择克氏原螯虾幼苗作为底栖动物的考察目标。EM菌(Effective Microorganisms)是一种常见且成熟的混合菌剂，能处理水体中有害废物，同时被动物摄入后可以增强动物免疫力，有利于动物生长和提高动物饲料转化率等[6]。笔者以EM菌作为改良底质的功能菌群，对比在4种不同基质下克氏原螯虾幼苗的存活和生长情况，以及不同土壤基底中微生物群落结构[7]、土壤有机碳和总氮含量的差异，旨在探究增强克氏原螯虾对凋落物土壤混合基质的适应性措施，为其在沿海滩涂养殖的推广提供技术支持。

试验采样地为列入《世界遗产名录》中的中国黄(渤)海候鸟栖息地，同样也是全球第二块潮间带湿地遗产、江苏省首项自然遗产，该研究将对盐城滨海滩涂湿地生态系统的功能提升及适应性管理有一定的实践应用意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验样地位于江苏盐城滨海湿地(N 32°34′～34°28′、E 119°48′～120°56′)，用采泥器收集江苏盐城滩涂淤泥，带回后干燥处理；收集互花米草凋落物，带回后晾干脱水并打碎；EM菌原液(光合细菌、乳酸菌、酵母菌等多种高效活性菌)由爱睦乐环保生物技术(南京)有限公司提供。

克氏原螯虾幼苗，体长(2.2±0.2) cm，体质量(600±100) mg，采自盐城滩涂潮沟咸淡水区域。试验水体采用充分曝气的自来水, 水温约25 ℃。饲养容器为高8 cm、直径8 cm的圆柱形透明塑料盒(图1)。

图1 饲养盒示意Fig.1 Schematic diagram of a feeding box

1.2 方法

1.2.1 饲养基底制备

清水基底：容器中加入100 mL水，此为清水组；

泥土基底：容器中添加1 cm的干燥土，加水保持100 mL上清液，此为泥土组；

互花米草基底：互花米草和干燥土按1∶24的质量比例均匀混合制成混合土。容器中添加1 cm厚的混合土，加水保持100 mL上清液，此为草泥组；

EM菌+互花米草基底：参照说明书，将EM菌液100 mL、水1000 mL、红糖100 g混合，恒温22 ℃置摇床间歇摇晃，培养10 d后制成发酵液，发酵液按1 mL∶1000 mL稀释1000倍。容器中添加1 cm厚的上述混合土，并加入稀释后的发酵液充分浸润，然后加水，保持100 mL上清液，此为EM组；

每组基底常温下静置3 d后投入克氏原螯虾幼苗。

1.2.2 分组、饲养与测定数据

试验分4组，每组30个平行。每盒放置1只克氏原螯虾幼苗。投喂饵料为江苏省淡水水产研究所配制的克氏原螯虾专用饵料，蛋白水平35%，隔2 d投喂1粒，每粒40 mg，残饵不除。室温饲养持续30 d后，统计克氏原螯虾幼苗存活率及体长(L)和体质量(m)生长指标，对体长和体质量的关系进行拟合，计算肥满度(CF=m/L3)。肥满度又称丰满系数，是体长和体质量关系的另一种表达式，可衡量克氏原螯虾的肥瘦程度[8]。

试验结束后采用16S rDNA法来测定基底土壤中微生物群落结构、采用重铬酸钾容量法—外加热法测定土壤总有机碳(TOC)、采用半微量凯式法测定总氮(TN)[9]。

1.3 数据处理

试验结果以平均值±标准差表示。利用SPSS 26.0统计分析，采用卡方检验对存活率等数据进行检验，采用单因子方差分析对体长增长量和体质量增加量等数据进行方差分析。

2 结 果

2.1 存活率比较

根据各组存活率及卡方检验结果(表1)得出，相较于只有互花米草底泥的草泥组，经EM菌活化底泥后的EM组克氏原螯虾幼苗的存活率显著提高，与清水组和泥土组无显著差异。该结果表明底泥中混入互花米草凋落物对克氏原螯虾幼苗的存活有显著抑制作用，经EM菌活化后能抵消这一抑制。

表1 各组存活率及显著性检验

2.2 体长、体质量的比较

试验结束后，克氏原螯虾的体长排序为EM组>草泥组>泥土组>清水组(图2)。EM组的克氏原螯虾幼苗平均体长最大，平均增长量显著高于其他3组，而其他3组间的平均增长量无显著差异(表2)。试验结果表明，经EM菌活化后的互花米草底泥对克氏原螯虾幼苗的体长有显著促进效果。

试验结束后，体质量分布规律与体长一致，即分布排序为EM组>草泥组>泥土组>清水组(图2)。EM组的克氏原螯虾幼苗平均体质量最大，平均增加量显著高于泥土组和清水组，与草泥组之间差异不显著(表2)。草泥组虽稍高于泥土组和清水组，但差异不显著。清水组和泥土组差异不显著。

图2 各组终末体长及终末体质量的分布Fig.2 Distribution of final body length and body mass in each group

表2 各组终末平均体长和体长增长量、平均体质量和质量增加量及显著性检验

2.3 体长和体质量的关系

2.3.1 体长与体质量关系式

体长与体质量关系式一般用幂函数m=aLb表示。将各组克氏原螯虾幼苗体长和体质量关系进行拟合，得出各组体长—体质量幂函数关系式如下：

清水组：m=5.8361×L1.5222(r2=0.8439)

泥土组：m=4.7033×L1.5834(r2=0.7506)

草泥组：m=1.3536×L1.9796(r2=0.8681)

EM组：m=1.0555×L2.0473(r2=0.7541)

Paulyt-检验法检验结果表明，各组b值均小于3，均与3存在显著差异，说明各组体长和体质量的生长不对等，均为异速生长类型。

2.3.2 肥满度比较

肥满度计算结果见图3，肥满度为清水组>草泥组>泥土组>EM组。EM组肥满度显著低于清水组，与其他2组差异显著；草泥组与其他3组均差异不显著(表3)。

图3 各组肥满度分布Fig.3 The distribution of condition factor in each group

表3 各组肥满度及显著性检验

2.4 底泥土壤性质比较

2.4.1 土壤细菌群落结构比较

选择物种丰度>1%的优势门，作相对丰度分布柱状图(图4)。各组土壤基质中细菌主要包括变形菌门、浮霉菌门、放线菌门、拟杆菌门及厚壁菌门，各组主要优势门占比略有差异。属水平上的细菌类群比较及卡方检验见表4，结果表明，在已命名的10个属中，相较于泥土组，互花米草组有3个属的菌群与其差异显著，EM菌组有4个属与其差异显著，而互花米草和EM菌组之间也有1个属的菌群差异显著。结合门水平物种分布及属水平显著性检验结果可知，在土壤中加入互花米草和加入添加EM菌的互花米草均会改变土壤细菌群落结构。

2.4.2 EM组与草泥组的有机碳及总氮的比较

土壤有机碳和总氮结果见表5，EM组有机碳和总氮含量显著低于草泥组。该结果表明，草泥组因互花米草腐解导致元素富集，从而积累了更多碳和氮。而EM组各指标含量较低，证明EM菌能加快互花米草的分解速度，释放出更多的碳源和氮源供克氏原螯虾幼苗生长所需。

图4 各组土壤样品在门分类水平上细菌类群比较Fig.4 Comparison of bacterial communities in soil samples in different groups at phylum level

3 讨 论

3.1 互花米草凋落物腐解对克氏原螯虾幼苗生存的影响

互花米草直接混入底泥的草泥组克氏原螯虾存活率显著低于其他3组，说明随着时间的延长，互花米草枯落物在底泥中慢慢腐解，造成土壤基质中缺氧，土壤生存环境严重恶化，导致克氏原螯虾无法存活。这与叶春等[10]的研究结果植物腐烂分解会营造厌氧环境，引发缺氧，及陈婷等[11]克氏原螯虾不喜欢污水的环境，幼虾甚至能被毒死的结论一致。本试验结果表明，底泥中混入互花米草凋落物不利于克氏原螯虾幼苗的存活，需要适当干预来改善其适应能力。

表5 草泥组和EM组土壤总有机碳、总氮的比较及显著性检验

Moriarty[12]发现，在斑节对虾(Penaeusmonodon)的养殖池中施用芽孢杆菌(Bacillus)后，斑节对虾成活率提高。本试验尝试添加EM菌来改善土壤环境，EM菌能加快植物秸秆的发酵，改良土壤[13]，还能净化养殖水体[14]。添加EM菌后克氏原螯虾幼苗存活率显著高于草泥组，与清水组和泥土组无显著差异，证明EM菌改善了互花米草在底泥中腐解造成的生境恶化现象，提高了虾苗存活率。

3.2 互花米草的流入对克氏原螯虾幼苗生长的影响

3.2.1 添加EM菌后对克氏原螯虾幼苗生长的促进

Wang[15]发现，在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)饲料中添加光合细菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)能促进其生长。本试验中，尝试添加EM菌，结果表明，添加EM菌后的互花米草组克氏原螯虾终末体长和体质量均高于其他3组，体长增长量显著高于其他3组，体质量增加量显著高于清水组和泥土组，与草泥组无显著差异。该结果表明，EM菌组克氏原螯虾的生长速度快于其他3组。这说明添加EM菌后不仅改善了恶化的环境，还加快了互花米草的分解过程，释放出更多养分到土壤系统中，再经食物链传递给消费者，克氏原螯虾幼苗通过摄食提高了自身的体质量。

3.2.2 单一互花米草底泥对克氏原螯虾幼苗生长的影响

由各组体长和体质量比较结果可知，单一互花米草底泥中的克氏原螯虾幼苗体长和体质量均高于清水组和泥土组，与EM组无显著差异，而EM组的克氏原螯虾幼苗已有显著的增长，所以一定程度上证明了互花米草底泥中存活者体质量的增长速度快于清水组和泥土组。这说明互花米草凋落物提供的高生产力直接增加了食物来源，进而通过营养级联作用在次级代谢过程中支撑了底栖动物。虽然互花米草凋落物在底泥中因腐解自身流失了部分养分，但依然能为克氏原螯虾幼苗提供营养支持。互花米草属多年生C4草本植物，其凋落物作为食物链中基础食物资源，能够提升底泥对克氏原螯虾幼苗的支持能力，这也侧面证明了它的生态利用价值。

克氏原螯虾幼苗的体长和体质量关系符合m=aLb规律，且相关性较高[16]。而本试验4组间生长模式均为异速生长，不符合等速生长模式；肥满度比较中，EM组显著最低，其次为草泥组。以上结果均反映EM组体长发育较快。而克氏原螯虾幼苗在生长阶段会优先体长的生长，是其逃避捕食的重要生态适应[17]，这说明添加EM菌的底泥中的克氏原螯虾幼苗生存能力更强。

3.3 互花米草的流入对底泥土壤的影响

Gunther等[18]发现，在罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)饲料中添加芽孢杆菌不仅可促进其生长，还可降低其死亡率。由各组微生物菌群比较结果可见，泥土组与草泥组、EM组之间菌群结构存在差异，草泥组和EM组有更丰富的微生物菌群，能促进克氏原螯虾幼苗的生长。而草泥组和EM组之间也有1个属的菌群占比差异显著，通过进一步测量草泥组和EM组中底泥的土壤有机碳和总氮含量发现，EM组土壤有机碳、总氮含量显著偏低。土壤有机碳主要来源于植物凋落物、土壤腐殖质等，且受总氮等多种环境因素的影响[19]。高建华等[20]认为，互花米草群落地上生物量和植被盖度最高，生成凋落物较多，植物凋落物分解缓慢，土壤有机碳大量积累使土壤有机碳含量最高。通常认为凋落物的分解速率与氮含量呈正相关。这也证明了在底泥中加入EM菌后能加快互花米草的分解速度，释放更多的碳源和氮源。土壤氮元素和碳元素作为生态系统中最主要的生源要素[21]，能为克氏原螯虾提供更多生物支撑，从而促进其生长。EM菌的加入进一步改变了底泥中微生物群落结构和土壤理化性质，而且EM菌能加快互花米草在底泥中的分解，改善了腐解造成的生境恶化现象。说明EM菌作为功能性菌群能保持各种菌间的协同作用，效果显著。

朱丽叶等[22]研究发现，微生物菌剂对水产动物生长的促进作用可以从多个方面进行探究，如细菌的代谢产物富含多种营养物质，进入消化道后生长繁殖，促进动物胃肠道消化酶分泌，同时自身分泌消化酶促进营养物质吸收等。鉴于本试验中互花米草凋落物及其腐解产生的累积效应，未来笔者将探索更加有效的微生物制剂，使其既能促进底栖动物的生长情况，又能改善互花米草生长区底栖动物的生存环境，从而进一步提高生境土壤的竞争力，增加互花米草的生态利用价值，以用代治。

4 结 论

互花米草有较高的生产力，而且入侵面积广，与其治理，不如利用。互花米草凋落物作为食物链的基础食物提供者，它的流入提升了土壤底泥对克氏原螯虾的支持能力，而EM菌也能改善底泥中互花米草快速腐解累积所造成的生境恶化现象，并促进其分解。本试验方法效果显著，丰富了EM菌协助克氏原螯虾对凋落物与土壤混合基质的响应和适应，不仅可以为其在沿海滩涂养殖的推广提供技术支持，还可提高互花米草的生态利用价值，为滩涂湿地生态系统的保护与恢复提供参考。