骨髓间充质干细胞治疗激素性股骨头坏死的分子机制与大豆异黄酮的调节作用

张立岩，孙 新，徐晓蕾，李 岩，王 强，詹东铭，朱家博，聂 影，张雪峰

(1.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011；2.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013；3.北华大学公共卫生学院，吉林 吉林 132013；4.吉林市中心医院，吉林 吉林 132011)

随着现代医学的飞速发展，激素类药物成为一种临床应用广泛、治疗效果较好的药物.激素类药物使患者获益的同时，也带来了不少问题，如发生激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH).激素性股骨头坏死是由于患者长期或大剂量使用激素类药物，导致股骨头供血减少，进而导致股骨头结构改变，影响关节功能.SONFH是一种进展性疾病，随着病情不断发展，患者股骨头会出现结构塌陷和关节障碍.由于修复坏死组织的困难及高致残率，SONFH在医学界得到了广泛关注.临床上对于股骨头坏死分为手术治疗和保髋治疗.保髋治疗主要适用于股骨头坏死早期及股骨头尚未塌陷或塌陷不明显阶段.近年来，随着精准医学的发展以及干细胞和分子生物学的深入研究，使用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)治疗SONFH已经成为基础试验和临床早期干预治疗研究的热点，但是目前促进BMSCs向成骨、成软骨分化的调控机制尚不清楚，因此，本研究主要探讨大豆异黄酮调节BMSCs分化对治疗SONFH的作用，为临床治疗SONFH提供参考.

1 SONFH的发病机制

目前，SONFH的具体发病机制尚不清楚，认为是多种因素共同作用的结果.20世纪70年代，有学者[1]提出弥散性血管内凝血理论，在一些SONFH患者的股骨头病理检查中发现血管内有血栓形成，并发现肝素有抑制SONFH的发生和发展的作用.还有学者[2]提出关于激素性股骨头坏死的炎症和细胞凋亡理论.糖皮质激素可通过TLR4信号通路干扰免疫应答，诱导SONFH，提示免疫应答的破坏在SONFH发病机制中发挥作用.目前，多数学者普遍认为SONFH发病机制学说主要有以下几种：脂质代谢紊乱及骨内压增高学说；血管内凝血与血管损伤学说；骨细胞凋亡学说；基因控制学说[3].越来越多的证据表明：BMSCs成骨和成脂分化能力的不平衡是造成SONFH的主要原因，糖皮质激素可通过激活或抑制成骨和成脂细胞相关调控基因的表达来调节BMSCs的分化.但由于患者长期或大剂量应用激素类药物，促进BMSCs向成脂肪细胞分化，促进成骨细胞和骨细胞凋亡，增加了破骨细胞的数量，使BMSCs的数量难以提供足够的成骨细胞来满足骨重塑，最终导致骨坏死[4].另一方面，BMSCs向成脂细胞分化后，致使骨髓腔内脂肪细胞数量增多，体积增大，造血细胞数量减少；脂肪细胞堆积引起骨髓腔内压增高，髓腔内血管受到挤压，股骨头静脉回流受阻，血液瘀滞，血管栓塞，最终导致细胞组织供氧不足，细胞功能出现障碍，从而导致股骨头坏死的恶性循环[5].

2 调控BMSCs分化的细胞通路

2.1 Wnt/β-catenin 信号通路

Wnt信号传导途径是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径，Wnt信号通路参与了人的发育、生长和疾病发生的多种过程.Wnt/β-catenin信号通路(Canonical Wnt/β-catenin pathway)是由Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受体蛋白Dishevelled(Dsh)、糖原合成激酶3(GSK3)、APC、Axin、β-连环蛋白及TCF/LEF家族转录调节因子等构成.Wnt/β-catenin 信号通路是Wnt 信号转导途径中的一条重要通路，可通过多种机制作用于骨形成过程，如促进BMSCs和成骨细胞的增殖、诱导BMSCs向成骨细胞分化、抑制成骨细胞凋亡和骨细胞凋亡等[6].LONG等[7]研究发现：MIR-139-5p通过直接靶向Wnt/b-catenin途径的关键因子CTNNB1和FZD4，在Wnt/b-catenin途径发挥其在BMSCs成骨中的作用，抑制miR-139-5p可显著促进BMSCs向成骨细胞分化，而过表达miR-139-5p则会降低BMSCs向成骨细胞分化.WANG等[8]通过构建了包含hApN基因的重组腺病毒，然后将该腺病毒体外转染到BMSCs中，证明脂联素ApN直接作用于BMSCs.脂联素ApN通过Wnt/β-catenin途径促进BMSCs成骨分化和骨形成.SHI等[9]研究表明：血管活性肠肽(VIP)可通过Wnt/β-catenin信号通路促使大鼠BMSCs向成骨细胞分化，增强大鼠BMSCs成骨分化过程中血管生成标志物VEGF的表达，通过促进血管生成而促进体内成骨分化.

2.2 PPARγ 信号通路

过氧化物酶体增殖物激活型受体(peroxis- omeproliferator-activated receptor，PPARγ)是一种配体激活的核受体，是核激素受体超家族的成员，在BMSCs分化阶段能促进BMSCs向脂肪细胞分化，并抑制BMSCs向成骨细胞分化.KONG等[10]研究发现：中药活骨方可以通过PPARγ信号通路调节脂代谢，抑制PPARγ表达，进而减少BMSCs 向脂肪细胞的分化，增加向成骨细胞分化，从而阻止小鼠发生骨坏死.LI等[11]研究表明：丹酚酸 B可以抑制大鼠模型中PPARγ的表达，增加Ⅰ型胶原蛋白的表达，从而减少BMSCs向脂肪细胞的分化，阻止大鼠模型发生SONFH.

2.3 PI3K-AKT-mTOR信号通路

磷脂肌醇3-激酶(pho-sphati-dylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是生物体内较为重要的信号通路，作用于调控细胞增生、代谢、分化、凋亡和血管生成等过程.ZHAO等[12]证明了在BMSCs分化阶段，益母草碱通过PI3K/Akt/mTOR途径激活了BMSCs的自噬，并增加了自噬相关蛋白的表达，促进BMSCs向成骨细胞分化.LUO等[13]发现淫羊藿苷Ⅱ(ICS Ⅱ)通过PI3K/AKT/mTOR/S6K1信号通路促进了BMSCs的增殖，抑制了碱性磷酸酶(ALP)的活性，能够显著增加成骨蛋白/基因的表达，提高Akt和S6K1的磷酸化水平，减弱p-Akt、p-S6K1和成骨蛋白/基因的表达，促进犬BMSCs的成骨分化.

2.4 TGF-βSmad 信号通路

转化生长因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β) 是一种多功能细胞因子，在正常发育和体内平衡中具有重要作用，可通过促进BMSCs的增殖、向成骨细胞分化和生成骨基质等促进骨形成.LIU等[14]研究表明：含锶α-半水硫酸钙(Sr-CaS)在体外和体内均可通过TGF-β/Smad2/3分子信号通路促进BMSCs的成骨分化，且随着Sr浓度的增加而增强.Sr-CaS还可上调TGF-β、Smad2/3和β-catenin的表达，随着Sr含量的增加而增强.HU等[15]研究表明：MOTS-c能够通过TGF-β/Smad途径促进BMSCs向成骨细胞分化，MOTS-c可以上调ALP、BGLAP和Runx2的表达水平，并提高BMSCs的成骨能力.

3 骨代谢基因在调控BMSCs分化中的作用

3.1 Runx2

Runx2属于转录因子家族，是Runx家族的重要成员，使BMSCs只向成骨细胞或软骨细胞分化，并能够促进成骨细胞成熟，在成骨细胞分化过程中起重要作用.KOMORI T等[16]研究显示：激素能够下调BMSCs中 Runx2蛋白的表达，促进BMSCs向成脂方向分化.Runx2、SP7和Wnt信号相互调节，引导BMSCs向成骨细胞分化，从而抑制脂肪细胞和软骨细胞的分化.LI等[17]研究显示：芦荟蛋白通过激活ERK1/2-Runx2信号通路促进BMSC的成骨分化，用信号转导抑制剂PD98059(ERK1/2)处理BMSC可有效减弱这些细胞中Runx2的激活，并抑制成骨细胞分化.

3.2 Osterix

Osterix是成骨细胞特异性转录因子，属于SP1转录家族成员，可在成骨细胞分化为成熟成骨细胞和成骨细胞的过程中激活基因库，在成骨细胞生成、分化和骨形成过程中具有至关重要的作用.LIU等[18]研究发现：miR-96通过靶向osterix来调节成骨作用，miR-96的过表达减少了BMSCs的成骨分化，而miR-96的抑制作用则增加了BMSCs的成骨分化.LAI等[19]研究表明：Nell-1通过正反馈激活了Runx2和Osterix，并提高了Runx2的磷酸化水平，促进BMSCs的成骨分化.随着时间的延长，Runx2可进一步上调Osterix的表达，从而促进成骨细胞的分化和成熟.

4 大豆异黄酮的生物学特性和功能

大豆异黄酮(Soybean Isoflavone，SI)是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，因其分子结构与雌激素相类似，是一种具有雌激素样作用且对人体有益的天然活性物质，故又称之为植物雌激素(phy-toestrogen)[20].大豆中天然存在的SI总共有12 种，可以分为3 类，即黄豆苷类(Daidzin groups)、染料木苷类(Genistin groups)、黄豆黄素苷类(Glycitin groups)，每类以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在[21].其中，染料木黄酮(Genistein)和黄豆黄苷(Glycitein)是游离型苷元中最主要的2种成分.从20世纪80年代起，很多研究[22-23]及动物实验表明SI具有多种生物学活性.KANG N H等[24]通过研究SI对前列腺癌细胞进程的影响，认为SI可通过(ER)β途径调节控制细胞周期和细胞存活的基因表达，进而对细胞周期的G2期和M期产生抑制作用，使癌细胞周期停滞，促进癌细胞凋亡.研究[24]表明：胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的水平升高可增加罹患癌症的风险，LEE J等[25]发现SI可通过减弱IGF-1诱导的β-catenin信号传导有效抑制IGF-1刺激癌细胞的生长.SI对骨质疏松也具有积极的预防和治疗作用，SI能够调节破骨细胞[26]、成骨细胞及骨细胞[27]之间的动态平衡.骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种因破骨细胞介导的骨再吸收多于成骨细胞介导的骨形成，以骨强度减弱、易发生骨折为特征的全身代谢性骨病.SI可通过调节破骨细胞和调节成骨细胞及骨细胞间的动态平衡过程，预防和治疗骨质疏松.有研究[28]发现：SI还对心血管健康有积极作用，具有改善血管内皮细胞功能、抗血小板聚集等作用；还有研究[29-31]发现：SI对于改善AD患者症状有积极意义，SI具有抗氧化应激、抗神经毒性物质损伤、促进神经营养因子表达、保护血脑屏障、降低炎性反应作用.SI多样而突出的生物学活性引起了国内外研究者的广泛关注，特别是对骨质疏松有积极的预防和治疗作用.

5 大豆异黄酮调节骨髓间充质干细胞分化的作用机制

骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同体位环境诱导下，能实现多向分化，其结果是分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等多种细胞.如果分化诱导的条件发生改变，也可诱导定向分化体系的变化.随着对SI的研究深入，SI的促进骨髓间充质干细胞成骨分化和抑制破骨细胞分化及功能作用备受关注.如今人们已经认识到大豆异黄酮在不引发副作用的情况下对骨骼重塑具有积极作用[32].ZHANG等[33]研究发现：决定BMSCs向成脂肪细胞、成骨细胞分化的关键转录因子是PPARγ(成脂转录因子)，SI可通过抑制BMSCs中的PPARγ表达，增强Runx2(成骨转录因子)的表达，促进BMSCs成骨分化，减少脂肪细胞生成.与TNF受体有关的蛋白质RANKL(破骨细胞分化因子)和OPG(骨保护素)比率的动态平衡在介导破骨细胞分化中起重要作用.CHEN等[34]发现：SI主要通过激活MAPK/NF-κB/AP-1而诱导ERα基因表达，调节细胞内OPG、RANKL、RANK等蛋白之间比率平衡，通过抑制M-CSF等途径抑制破骨细胞骨吸收，调节骨代谢.BATEMAN M E等[35]认为，SI可通过ER途径使ASC(脂肪间充质干细胞)中的RUNX2和c-FOS表达增强，上调BMSCs中的LXRα、LXRβ、ABCA1、ABCA2、ABCG1和APOA1的基因表达，诱导ASC和BMSCs成骨.还有研究[36]表明：SI既可增加骨矿化所需的细胞外基质蛋白osteocalcin的表达，又可利用雌激素分子传导途径诱导成骨途径，在BMSCs分化的初始阶段和终末阶段都具有刺激成骨细胞成骨特性的能力.

综上所述，SONFH的发病机制尚未完全清楚，也可能是多种机制共同作用的结果.随着精准医学和干细胞、分子生物学研究的发展，探索SONFH的发病机制成为可能.研究SONFH的发病机制不仅有助于揭示该疾病的过程，还可以帮助筛查高危人群，采取预防和干预措施，最大限度地减少激素类药物治疗的副作用.目前，BMSCs治疗SONFH已经取得良好效果，但还需要不断的基础研究和大量的临床试验来完善治疗技术和方法.SI在促进成骨细胞分化、抑制破骨细胞生成方面具有积极作用，有望成为利用BMSCs治疗SONFH的新方向.相信随着现代医学的不断发展和医学工作者的不懈努力，利用SI调节BMSCs的分化对治疗SONFH会有突破性进展，为SONFH患者的保髋治疗带来福音.