基于网络药理学探讨鸡血藤对骨关节炎的作用机制*

黄淑霞，殷海波

1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053； 2.北京中医药大学，北京 100029

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是指由多种因素引起关节软骨纤维化、断裂、溃疡、脱失而导致的关节疾病，具有致残性。全球约有2.5亿人受该病影响，治疗方法主要包括减轻体质量、口服和局部使用非甾体抗炎药、关节内治疗等，但是难以收到有效且持久的疗效[1-3]。

近年来的临床研究显示，中医治疗OA疗效佳，相关数据挖掘结果表明，鸡血藤为治疗OA的常用药[4-6]，但是相关作用机制尚不明确。网络药理学是基因组学、蛋白质组学、代谢组学等学科的集合与发展，为新药研发提供了重要思路[7]。本文通过网络药理学研究，意在系统分析鸡血藤的有效成分、潜在作用靶点以及治疗OA的作用机制，以期为今后进一步实验研究与药物研发奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 活性成分筛选及相关靶点收集中药系统药理学分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是一个可以筛选中药药理学性质较优成分的数据库[8]。本研究通过 TCMSP 数据库(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)对鸡血藤的成分进行检索，并设置口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18作为ADME筛选条件，初步筛选出活性成分。之后在该平台上收集筛选所得活性成分的相关靶点信息，并于UniProt数据库[9](https：//www.uniprot.org)进行靶点蛋白与基因名称的统一匹配。

1.2 疾病相关靶点筛选以“Osteoarthritis”为关键词，在Drugbank数据库[10](https：//www.drugbank.ca)、TTD数据库[11](http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、Genecard数据库[12](https：//www.genecards.org)、OMIM数据库[13](http：//www.omim.org)进行检索，收集相关靶点。之后将以上4个数据库所得靶点信息进一步整合，删去重复值得到OA的潜在靶点。

1.3 鸡血藤“活性成分-靶点”网络构建通过鸡血藤“活性成分-靶点”网络构建，进一步探索两者之间的联系。将药物相关活性成分、靶点信息上传至Cytoscape 3.7.0[14]软件，运用Network Analyzer工具进行网络参数分析。其中Degree为重要参数，数值越大，代表该节点越重要。

1.4 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建利用Venny2.1在线平台(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对药物与疾病靶点绘制韦恩图，并提取交集基因。将交集基因上传至string11.0数据库，Organism选择“Homo sapiens”，将最低互相作用值设置为“highest confidence”(>0.9)，隐藏无相互作用蛋白，其余设置为默认值，得到PPI网络TSV文件，借助Cytoscape软件进行节点网络分析，得到蛋白质相互作用网络图。结合内置插件“cytoHubba”[15]分析，筛选出关键靶点。

1.5 KEGG通路富集分析及GO功能富集分析将鸡血藤作用于OA的潜在作用靶点导入Metascape平台[16]，物种选择人类，设置P<0.01，分别进行KEGG富集分析、GO富集分析，其中GO分析包括生物过程(biological processes，BP)，细胞功能(molecular function，MF)，细胞组分(cell composition，CC)。对所得富集分析结果按P值进行升序排列，筛选重要的前20位条目，相关数据信息上传Omicshare平台(https：//www.omicshare.com/)，绘制气泡图，实现数据可视化。

2 结果

2.1 鸡血藤的活性成分及其靶点经过OB、DL两个ADME参数初步提取出24个成分，对24个活性成分进行手动检索相关靶点信息，剔除未查询到相关靶点的成分，最终获得23个活性成分，见表1。相关作用靶点进行基因匹配，删除无效值与重复值，共得到135个靶基因。

表1 鸡血藤活性成分

2.2 骨关节炎靶点预测结果将“Osteoarthritis”作为关键词在多个疾病数据库检索，在Genecard数据库获得2 885个基因，根据经验设定Relevance score大于中位数的靶点为潜在作用靶点，整合Drugbank数据库(82个)、TTD数据库(13个)、OMIM数据库(69个)靶基因，最终获得独立而有效的基因835个。

2.3 “鸡血藤-活性成分-靶点”网络构建将鸡血藤23个活性成分，135个作用靶点导入Cytoscape软件，进行“药物-活性成分-靶点”关系图构建，见图1，网络中共159个节点，440条边。黄色圆圈代表鸡血藤，粉色圆圈代表鸡血藤活性成分，蓝色六边形为活性成分潜在作用靶点，图形面积越大，代表节点的Degree值越大，提示相应的生物功能越重要。

图1 药物-活性成分-靶点图

2.4 鸡血藤治疗OA的PPI网络构建得到的药物和疾病的独立作用靶点上传至Venny2.1，得到交集基因53个，绘制韦恩图，见图2。将53个交集映射基因导入String数据库进行PPI分析，得到TSV文件通过Cytoscape软件进行可视化处理，得到PPI网络图，见图3。图中共有48个节点，225条关系路线，平均节点度值为8.49，平均局部聚类系数为0.53，节点图形大小及颜色随着Degree值增大而变大、加深，连接线段也相应增粗。通过cytohubba插件，使用MCC算法筛选出前10个关键基因，见图4，颜色越深表明重要程度越高。

图2 鸡血藤-骨关节炎靶点韦恩图

图3 靶基因的PPI网络图

图4 PPI网络中的关键节点

2.5 GO功能与通路富集分析运用Metascape数据平台对鸡血藤治疗OA相关靶点进行富集分析后，借助Omicshare平台进行数据可视化，见图5-图8。图中气泡大小取决于通路上的基因数，颜色代表P值，数值越小，富集程度越高[17]。GO的BP主要包括：细胞因子介导的信号通路(cytokine-me-diated signaling pathway)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、T细胞活化(Tcell activation)、T细胞增殖(Tcell proliferation)、对无机物的反应(response to inorganic substance)、平滑肌细胞增殖的正调控(regulation of smooth muscle cell proliferation)等；GO的CC主要涉及：膜筏(membrane raft)、膜微结构域(membrane microdomain)、髓鞘(myelin sheath)、核膜(nuclear membrane)等；GO的MF主要涉及：细胞因子受体结合(cytokine recepto rbinding)、蛋白质结合(protein binding)、转录因子结合(transcriptionfactor binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、生长因子的结合(growth factor receptor binding)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)等；KEGG通路分析显示靶点主要富集在：癌症通路(Pathways in cancer)、乙型病毒性肝炎通路(HepatitisB)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、内分泌抵抗(Endocrine resistance)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-kappaB signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)等。综上，鸡血藤治疗OA是通过调节复杂的生物过程及信号通路而实现的。

图5 GO-BP分析

图6 GO-CC分析

图7 GO-MF分析

图8 KEGG信号通路分析

3 讨论

骨关节炎属于中医痹证范畴。《素问·痹论》云：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹……以冬遇此者为骨痹……痹在于骨则重。”现多称之“骨痹”。中医认为肝肾、气血亏虚为发病内在因素，风寒湿热、外邪、外伤、劳损为外在因素，痰瘀阻滞是主要病机[2]。《类证治裁·痹证》曰：“痹久必有瘀血。”有医家认为瘀血贯穿整个OA病程始终[18]。OA相关证型研究则显示瘀血痹阻是主要证型之一，因此活血化瘀为治疗OA的重要方法[19-20]。《饮片新参》记载了鸡血藤“去瘀血，生新血，流利经脉，治风血痹证。”《纲目拾遗》曰其“活血，暖腰膝。”表明活血舒筋的鸡血藤是治疗OA的合适药味。

根据“药物-活性成分-靶点”关系图，鸡血藤的主要作用成分有β-谷甾醇、木樨草素、豆甾醇、芒柄花素、甘草查尔酮a等。β-谷甾醇具有重要的抗炎作用，能够减轻关节疼痛。其抗炎机制复杂，可以使STAT1和NF-κB信号转导失活、降低促炎因子水平、提高抗炎因子IL-10的浓度而起到抗炎作用，也可能与调节L型电压依赖性钙通道、PI3K活性等相关[21-23]。木樨草素作为一种天然黄酮类物质，具有治疗OA的潜力，表现在抗炎多途径：包括影响花生四烯酸的代谢和多种炎性信号通路(NF-κB 信号通路、MAPK和AP-1信号通路、JAK和STAT信号通路)，显著抑制巨噬细胞炎症因子化及血管生成因子的表达等[24-25]。豆甾醇可以显著抑制MAPK及NF-κB信号通路的激活，减少促炎介质(TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和COX-2)的表达，从而达到良好的抗炎效果[26]。

本研究通过网络拓扑分析中的Degree值以及MCC算法，筛选出较为重要的靶点：STAT3、AKT1、TNF、VEGFA、MAPK1、IL-6、PTGS2、CASP3、MYC、JUN、IL-1B、IL-10、RELA等。实验证明STAT3阻断剂对OA小鼠的软骨破坏具有保护作用。IL-6 是骨关节炎发病的主要细胞因子，能够诱导软骨细胞中的STAT3和ERK1/2通路，上调参与OA发病机制的主要蛋白酶(MMP-3和MMP-13，ADAMTS-4和ADAMTS-5)的产生，从而导致软骨退化。临床研究结果显示，KOA患者血清IL-6水平较健康对照组明显升高，可作为临床早期诊断和评估疾病的指标[27-28]。TNF-α 作为常见炎症介质，可由巨噬细胞、纤维母细胞、软骨细胞等产生[29]，能够抑制成骨细胞的DNA和胶原合成以及骨钙素基因的表达。实验表明TNF-α是破骨细胞的重要分化因子[30]，在促炎级联反应中，TNF-α激活最重要的NF-κB/p65转录途径，进而分泌IL-6和IL-8，导致OA加重[31]。随着OA病情的发展，患者血清TNF-α水平也明显增高[32]。而VEGFA在软骨发育过程中也发挥着重要作用，其高水平表达与OA发病密切相关，能够刺激软骨血管化，促进氧化损伤和炎症因子的交换，常常预示着OA前期[33]。相较于正常滑膜组织，OA组织PTGS2呈现高表达，导致IL-6、TNF-α 表达也增强。抑制PTGS2的产生，能够有效阻止滑膜成纤维细胞增殖和关节破坏[34]。

GO富集分析及KEGG通路结果显示，鸡血藤能通过调控炎症因子的表达及影响其信号通路等达到治疗OA的作用。PI3K/Akt信号通路，目前已经被证实与OA相关。IL-1β、IL-6是参与PI3K/AKT信号通路的重要炎症因子，降低软骨组织中的这些炎症因子水平或上调该信号通路的p-PI3K、p-AKT 的表达量以抑制线粒体细胞凋亡，能保护关节软骨[35-37]。NF-κB在机体内参与炎症反应、细胞凋亡、细胞自噬等多种反应过程，与OA相关的炎症通路尤为重要。OA软骨细胞产生大量促炎因子，激活NF-κB信号通路，导致胶原和蛋白多糖的再生较少，进一步增加软骨损伤[38-39]。IL-17能够促进多种炎症因子的表达，其介导的信号通路通过参与关节软骨的表达和活化，激活NF-κB，启动炎症反应而引起软骨病变[40]。研究显示IL-17在小鼠关节局部表达能够引起急性炎症和软骨蛋白糖化[41]。临床研究结果显示OA患者无论是血清还是关节滑液中的IL-17水平，均高于健康对照组，说明其含量可能与患者关节疼痛程度、病情进展等相关[28，42]。

综上所述，本文借助网络药理学初步分析发现，鸡血藤的主要活性成分为β-谷甾醇、木樨草素、豆甾醇等，涉及治疗OA的STAT3、AKT1、TNF、VEGFA、IL-6、PTGS2、CASP3等可能为关键靶点，PI3K/Akt、NF-κB、IL-17等信号通路为治疗OA的关键途径。表明鸡血藤治疗OA通过多活性成分、多靶点、多通路实现，一定程度上验证了鸡血藤作为临床治疗OA常用药的可行性，也为今后相关实验研究、药物开发提供了理论依据。由于关于鸡血藤的临床及实验研究及各数据库的局限性，中药在临床治疗中辨证论治等诸多因素影响，今后仍需要不断深入研究。