虎杖苷通过抑制miR-301a促进胃癌SGC-7901细胞凋亡的机制研究

肖永琴，张 珂，曹静平

（1.四川省肿瘤医院，四川 成都 610041；2.重庆医科大学附属儿童医院，重庆 400000）

目前，胃癌是常见的恶性消化道肿瘤之一，因早期诊断率较低，且总体上预后较差，所以胃癌的发病率高、死亡率高[1]。已有研究表明，中医药能够通过调节多个信号通路诱导胃癌细胞的凋亡[2-3]。因此研究中医药治疗胃癌具有重要意义。

虎杖苷（polydatin，PD）是从虎杖的干燥根茎中提取的单体成分，也可在多种植物中被提取。药理研究表明，虎杖苷具有抗炎[4]、抗过敏[5]、抗肿瘤[6]的功效。虎杖苷的抗肿瘤作用已在多种肿瘤中证实，例如鼻咽癌[7]、肺癌[8]、乳腺癌[9]等。本研究以人胃癌SGC-7901为研究对象，探究虎杖苷通过调节miR-301a表达进而促进胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用机制，为后续进一步研究抗肿瘤药物靶点提供基础。

1 实验材料

1.1 细胞 人胃癌细胞株SGC-7901（CL-0206）、人正常胃上皮细胞GES-1（CL-0563）购于武汉普诺赛生命科技有限公司，用含有10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2的细胞培养箱对细胞进行培养。

1.2 药物与试剂 虎杖苷（polydatin，批号：HY-N0120A，纯度为98.95%，美国Med Chem Express公司）；细胞培养基RPMI-1640（货号：PM150110，上海雅吉生物科技有限公司）；青链霉素（货号：30-004-ci，corning公司）；胎牛血清（货号：abs972，上海优宁维生物科技有限公司）；胰蛋白酶（货号：T4049，Sigma公司）；逆转录试剂盒（货号：RR037A）、荧光定量PCR检测试剂盒（货号：DRR096A）（大连宝生物工程有限公司）；Lipo6000 TM转染试剂（货号：C0526）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1062M）、CCK8试剂盒（货号：C0038）（碧云天生物科技有限公司）；GAPDH（货号：AF5009，小鼠单抗，碧云天生物科技有限公司）；Survivin抗体（货号：ab469，兔多抗）、Bcl-2抗体（货号：ab59348，兔多抗）、Bax抗体（货号：ab182733，兔单抗）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（货号：ab205718）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）（货号：ab6789）（abcam公司）；miR-301a及NC-mimics由上海吉玛制药公司设计并合成。

1.3 主要仪器Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CFX Connect型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；ZE5型流式细胞仪（美国Bio-Rad公司）；Micro21R型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2 实验方法

2.1 细胞分组与转染 取处于对数生长期的SGC-7901细胞（密度为2×105）接种于6孔板中，实验分组为：（1）对照组、miR-301a mimics组、NC mimics组；（2）对照组、虎杖苷组、虎杖苷+miR-301a mimics组、虎杖苷+NC mimics组。按照实验设计分别转染SGC-7901细胞，分别用100μL无血清RPMI-1640培养基稀释5μL Lipo6000 TM转染试剂和100 pmol转染物，室温静置5 min，然后混合，在室温静置5 min。将该混合物均匀滴加到孔内，轻轻混匀。8 h后更换完全培养基，置于培养箱中培养48 h。

2.2 CCK8实验 取处于对数生长期的SGC-7901细胞（密度为5×103）接种于96孔板中，具体分组为：（1）对照组、50μmol/L虎杖苷组、100μmol/L虎杖苷组、150μmol/L虎杖苷组；（2）虎杖苷组、虎杖苷+miR-301a mimics组、虎杖苷+NC mimics组。进行不同浓度的虎杖苷处理或转染NC/miR-301a mimics后，培养24、48、72 h后，向每孔中加入20μL CCK8试剂，并在培养箱中继续培养4 h，然后使用酶标仪测定其450 nm处吸光度值。

2.3 qRT-PCR实验 根据TRIzol Reagent使用说明书提取人SGC-7901和GES-1细胞中的总RNA，并按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。按照说明书配制qRT-PCR反应体系，反应条件为95℃预变性30 s，40个循环扩增反应（95℃5s，60℃20 s）。以U6为内参，通过2-△△Ct法计算miR-301a的相对表达量。具体引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取处于生长期的SGC-7901细胞至6孔板中，具体分组为：（1）NC组、50μmol/L虎杖苷组、100μmol/L虎杖苷组、150μmol/L虎杖苷组；（2）虎杖苷组、虎杖苷+miR-301a mimics组、虎杖苷+NC mimics组。进行不同浓度的虎杖苷处理或NC/miR-301a mimics转染后培养48 h。然后用0.25%胰酶对人SGC-7901细胞消化，1 000 r/min离心5 min，收集细胞。然后加入500μL的1×binding buffer对细胞进行重悬，加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI并轻轻摇晃混匀，室温避光孵育10 min，使用流式细胞仪上机检测，并计算细胞的凋亡率。

2.5 Western blotting实验 取处于生长期的SGC-7901细胞至6孔板中，进行处理或转染后培养48 h。收集细胞并使用细胞裂解液对细胞进行裂解，使用BCA法进行蛋白定量。配制浓缩胶和分离胶，取25μg蛋白进行上样，采用恒压进行电泳，然后湿转至PDVF膜上。使用5%的脱脂奶粉对膜封闭1 h。加入相应的一抗（1∶1 000），4℃过夜孵育，1×PBST清洗3次。加入二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，1×PBST清洗3次。在膜上逐滴加入ECL显影液进行显影，并通过Image J软件对蛋白条带进行分析。

2.6 统计学方法 使用Graph Pad Prism 8统计学软件对实验数据进行分析，计量资料均用（±s）表示，两组数据之间比较则采用t检验。3组及3组以上数据间的比较先采用单因素方差分析（ANOVA），当确定具有显著差异时，再进行LSD-t检验。以P〈0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 虎杖苷对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响CCK8实验结果显示，与对照组比较，虎杖苷在不同时间梯度处理后，对人胃癌SGC-7901细胞增殖能力均有一定程度的抑制作用，具有一定的时间依赖性。虎杖苷在不同浓度梯度处理后，细胞增殖速率减缓具有一定的剂量依赖性，差异有统计学意义（P〈0.05）。为此选用150μmol/L虎杖苷处理48 h进行后续相关实验。（见图1A）

流式细胞术实验结果显示，与对照组比较，虎杖苷处理后，人胃癌SGC-7901细胞凋亡率增加，且具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P〈0.05）。（见图1B）

图1 虎杖苷对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响

3.2 虎杖苷对胃癌SGC-7901细胞中miR-301a表达的影响qRT-PCR结果显示，与人正常胃上皮细胞GES-1细胞比较，miR-301a在人胃癌SGC-7901细胞中高表达（P〈0.05）。（见图2A）与对照组比较，在人胃癌SGC-7901细胞中使用虎杖苷处理后miR-301a表达量降低，且具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P〈0.05）。（见图2B）

图2 虎杖苷对胃癌SGC-7901细胞中miR-301a表达的影响

3.3 miR-301a过表达能够部分消除虎杖苷抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的作用qRT-PCR结果显示，与对照组比较，转染miR-301a mimics组的细胞中miR-301a表达量增加，差异有统计学意义（P〈0.05）；转染NC mimics组中miR-301a表达与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见图3A）与虎杖苷组比较，虎杖苷+miR-301a mimics组中miR-301a表达增加（P〈0.01）；而虎杖苷+NC mimics组miR-301a表达与虎杖苷组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见图3B）

CCK8实验结果显示，与虎杖苷组比较，虎杖苷+miR-301a mimics组中胃癌SGC-7901细胞增殖能力增加（P〈0.05）；而虎杖苷+NC mimics组胃癌SGC-7901细胞增殖能力与虎杖苷组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见图3C）

流式细胞术实验结果显示，与虎杖苷组比较，虎杖苷+miR-301a mimics组中胃癌SGC-7901细胞的凋亡率降低（P〈0.05）；而虎杖苷+NC mimics组中细胞凋亡率与虎杖苷组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见图3D）

图3 miR-301a过表达能够部分消除虎杖苷抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的作用

3.4 miR-301a过表达能够部分消除虎杖苷抑制凋亡相关基因的表达Western blotting实验结果显示，与对照组比较，虎杖苷处理的胃癌SGC-7901细胞中survivin、Bcl-2蛋白含量表达降低（P〈0.05），Bax蛋白表达增加（P〈0.05）。与虎杖苷组比较，虎杖苷+miR-301a mimics组中胃癌SGC-7901细胞中survivin、Bcl-2蛋白含量增加（P〈0.05），Bax蛋白含量下降（P〈0.05），而虎杖苷+NC mimics组中蛋白表达与虎杖苷组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见图4）

图4 miR-301a过表达能够部分消除胃癌SGC-7901细胞中虎杖苷抑制凋亡相关基因的表达

4 讨 论

胃恶性肿瘤起源于胃壁最表层的黏膜上皮细胞，可发生于胃的各个部位[10]。临床上常应用顺铂、紫杉醇、奥沙利铂等对胃癌进行治疗，但是具有一定的副作用[11]。现代中医学家认为脏腑阴阳失调、气滞血瘀、肺气抑郁等是多种癌症发生的主要病因[12]。因此，应该以扶正培本、清热解毒、活血化瘀为中医药治疗癌症的基本原则。虎杖苷是一种天然活性成分，药理学研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[13-14]。钟华林等[7]研究发现虎杖苷能够通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路进而抑制鼻咽癌DNE-1细胞增殖及诱导细胞凋亡，且呈浓度依赖性。本研究结果显示不同浓度虎杖苷处理人胃癌SGC-7901细胞，能够抑制SGC-7901细胞增殖能力并诱导细胞凋亡，且对SGC-7901细胞增殖的抑制作用具有一定的剂量依赖性，提示虎杖苷在胃癌细胞中具有抗肿瘤作用。

MicroRNA是具有高度保守性的含有22个核苷酸的内源非编码蛋白质的小RNAs，其能够与mRNA的3’UTR端相结合进而发挥其调控作用[15]。近年来，有研究指出miR-301a是一种参与调节胃癌进展的致癌基因，但其潜在机制尚不清楚。有研究表明，miRNA-301a-3p表达在胃癌组织和胃癌细胞系中均上调，且miR-301a-3p的高表达与胃癌的不良预后有关；抑制miR-301a-3p的表达可抑制胃癌细胞AGS和MKN-45增殖、迁移和侵袭能力[16]。DOU J等[17]研究发现miR-301a模拟物可提高胃癌细胞活力，促进细胞迁移和侵袭。此外，已有研究证实虎杖苷可通过调控miRNA的表达水平在癌症中发挥抗肿瘤的作用[18]。本研究结果表明，与人正常胃上皮细胞相比，miR-301a在胃癌SGC-7901细胞中高表达；虎杖苷处理后SGC-7901细胞中miR-301a降低。当过表达miR-301a及虎杖苷处理后，能够引起细胞增殖，抑制细胞凋亡，且促凋亡蛋白含量降低，抑凋亡蛋白增加。提示miR-301a表达能够逆转虎杖苷对胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用并抑制细胞凋亡。

综上所述，虎杖苷能够抑制胃癌SGC-7901细胞增殖，促进细胞凋亡，其具体机制可能为虎杖苷通过抑制miR-301a表达进而抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖能力，促进细胞凋亡的发生，为进一步开发新的药物靶点提供科学的理论基础。