蒙药绍沙七味丸对心肌缺血大鼠的心脏保护作用及炎症机制研究*

敖道夫，荣 君，小 花，巴乙拉嘎，陈红梅

（内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028000）

心肌缺血（myocardial ischemia）是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。目前心肌缺血在我国的患病率呈逐年上升的趋势，已成为中老年人的常见病和多发病，甚至20～30岁的年轻人也出现心肌缺血的表现。临床上对严重的心肌缺血可实行冠脉搭桥术、冠状动脉介入治疗，但治疗费用昂贵，不易被广大患者所接受，药物治疗仍然是这类疾病的主要防治方式。

蒙药绍沙七味丸出自《验方》，是治疗心脏病的常用蒙药，由广枣、丁香、肉豆蔻、沉香、木香、阿魏、野牦牛心组成，具有抑心赫依、安神定志、增强心功能效果，用于治疗心赫依、心悸、心衰、气喘、失眠、胸痛、癫狂等症[1]，故沿用至今。该药物治疗心脏疾病疗效确切，对冠心病、心肌缺血、心绞痛、心悸、慢性心力衰竭等疾病临床疗效显著，无不良反应[2-4]，可达到标本兼顾的功效。本实验根据蒙药绍沙七味丸的临床应用情况及疗效，结扎左冠状动脉建立心肌缺血大鼠模型，探讨该药物对心肌缺血的保护作用及其炎症机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物11周龄SPF级SD雄性大鼠70只，体质量200～220 g，购自长春市伊斯实验动物技术有限责任公司，生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001，饲养温度22～25℃，湿度45%～65%，光照12 h明暗交替，给予标准饲料和饮用水，饲养环境为清洁级。本实验通过内蒙古民族大学附属医院医学伦理委员会的批准，批准号：NM-LL-2017-03-09-01。

1.2 药物与试剂 蒙药绍沙七味丸（内蒙古民族大学附属医院蒙药房，批号：20180225，规格：15 g/瓶），粉碎成细粉，用0.5%CMC-Na缓冲溶液配制成所需质量浓度使用；复方丹参片（郑州瑞龙制药股份有限公司，批号：180314）；CK-MB（批号：34413701）、LDH（批号：35625301）[罗氏诊断产品（上海）有限公司]；IL-6 ELISA试剂盒（批号：20160507A）、TNF-α ELISA试剂盒（批号：20160428A）（上海源叶生物科技有限公司）；NF-kB抗体（北京博奥森生物有限公司，货号：bs-1704R）。

1.3 主要仪器Animal Bio Amp心电图仪[艾德仪器国际贸易（上海）有限公司]；HX-300S动物人工呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；SC-05低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Cobas C311罗氏生化分析仪（日本hitachi high technologies公司）；SUNRISE酶标仪（奥地利亚Tecan）；RM2245石蜡切片机（德国LEICA公司）；HI1210组织烘片机（德国LEICA公司）；HI1220组织摊片机（德国LEICA公司）；EG1150H组织包埋机（德国LEICA公司）；101A-2E电热鼓风干燥箱（上海精宏实验室设备有限公司）；DHP-9082型电热恒温培养箱（上海精宏实验室设备有限公司）；U410-86超冷冻冰箱（英国Eppendorf公司）。

1.4 分组与给药 从70只大鼠中随机取10只作为正常组，其余60只大鼠按体质量随机分为模型组、蒙药绍沙七味丸低剂量组、蒙药绍沙七味丸中剂量组、蒙药绍沙七味丸高剂量组和复方丹参片组，每组12只。根据等效剂量计算，蒙药绍沙七味丸低、中、高剂量组大鼠分别以0.80、1.60、3.20 g/kg剂量灌胃蒙药绍沙七味丸溶液；复方丹参片组大鼠按0.25 g/kg剂量灌胃给予复方丹参片溶液，正常组、模型组大鼠给予等体积的蒸馏水。给药体积为2 mL/100 g，1次/d，连续给药14 d。

1.5 造模方法 大鼠手术前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛麻醉，固定在专用固定板上，连接生物机能实验系统，检测大鼠心电图，将大鼠气管切开，连接小动物呼吸机。方法如下：胸部备皮，沿左胸骨中线切开线形皮肤约2～3 cm缺口，在第4肋间开胸，扩胸，除去心包膜，挤出心脏，在左心耳根部和肺动脉圆锥交界处，穿细线结扎[5]。观察结扎线以下心肌颜色发生变化（左心室心肌呈充血暗红色，且前壁运动减弱），并且心电图S-T段显著抬高，说明成功复制急性心肌缺血动物模型[6]。

1.6 观察指标

1.6.1 血清指标的测定 造模成功后3 h从腹主动脉采血，置于室温10 min，低温高速离心机以3 500 r/min离心10 min，分离血清，全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）水平；ELISA法检测血清IL-6、TNF-α的含量。

1.6.2 心脏组织病理学观察 处死动物后取心脏组织固定在4%多聚甲醛中，石蜡包埋，3μm厚度切片做HE染色，光学显微镜400倍条件下观察心脏组织病理变化。

1.6.3 心脏组织NF-κB蛋白表达的检测 每组随机取6只大鼠心脏组织，在4%多聚甲醛固定，根据试剂盒的要求免疫组化法检测肾组织的NF-κB蛋白表达，免疫组化最后采用Motic Images Advanced3.2图像分析软件进行半定量分析，测定阳性表达强度用光密度值（OD值）表示；OD值越小阳性表达强度越弱既表达量少，OD值越大阳性表达强度越强既表达量多。每张切片400倍光学显微镜下，选取连续5个视野测定所得的平均值。

1.7 统计学方法 采用SPSS Statistics 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P〈0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

在造模手术过程中模型组死亡1只，原因为慢性心衰；蒙药绍沙七味丸低剂量组死亡2只，原因为呼吸衰竭、失血性休克；蒙药绍沙七味丸高剂量组死亡1只，原因为慢性心衰。因此，各组大鼠数量最终确定为10只。

2.1 各组大鼠血清CK-MB、LDH水平比较 模型组大鼠血清CK-MB、LDH水平均明显高于正常组（P〈0.01）；蒙药绍沙七味丸低、中、高剂量组和复方丹参片组大鼠血清CK-MB、LDH水平均明显低于模型组（P〈0.05或P〈0.01），蒙药绍沙七味丸中剂量组大鼠血清CK-MB水平低于复方丹参片组（P〈0.05），LDH水平与复方丹参片组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠血清CK-MB、LDH水平比较（±s，mmol/L）

表1 各组大鼠血清CK-MB、LDH水平比较（±s，mmol/L）

注：与正常组比较，aP〈0.01；与模型组比较，bP〈0.05，cP〈0.01；与复方丹参片组比较，dP〈0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）CK-MB LDH正常组 10 - 55.29±2.97 232.57±14.95模型组 10 - 173.59±9.16a 558.38±15.53a蒙药绍沙七味丸低剂量组10 0.80 165.13±6.57b 539.50±12.16b蒙药绍沙七味丸中剂量组10 1.60 158.39±7.52cd 498.14±10.93c蒙药绍沙七味丸高剂量组10 3.20 159.82±7.04c 508.83±13.30c复方丹参片组 10 0.25 165.04±7.13b 502.33±11.67c

2.2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量比较 模型组大鼠血清IL-6、TNF-α含量明显高于正常组（P〈0.01）；蒙药绍沙七味丸中、高剂量组和复方丹参片组大鼠血清IL-6含量均明显低于模型组（P〈0.05或P〈0.01），蒙药绍沙七味丸低剂量组大鼠血清IL-6含量与模型组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；蒙药绍沙七味丸低、中、高剂量组和复方丹参片组大鼠血清TNF-α含量均明显低于模型组（P〈0.05或P〈0.01）。（见表2）

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量比较（±s，pg/mL）

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量比较（±s，pg/mL）

注：与正常组比较，aP〈0.01；与模型组比较，bP〈0.05，cP〈0.01

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）IL-6 TNF-α正常组 10 - 18.26±1.67 49.64±4.83模型组 10 - 29.83±2.12a 63.41±6.59a蒙药绍沙七味丸低剂量组10 0.80 28.20±1.55 56.29±6.31b蒙药绍沙七味丸中剂量组10 1.60 26.63±0.92c 54.34±6.99c蒙药绍沙七味丸高剂量组10 3.20 27.27±1.50c 54.08±7.85b复方丹参片组 10 0.25 27.75±1.91b 54.31±6.39c

2.3 各组大鼠心脏组织病理学改变情况 正常组大鼠心肌纤维排列规则、紧密，心肌纤维细胞核长椭圆形，心肌纤维间未见出血、渗出物、炎症细胞；模型组大鼠大部分心肌纤维排列紊乱、松散、心肌纤维断裂、细胞核固缩，心肌纤维间可见大量出血、渗出物，少量炎症细胞；蒙药绍沙七味丸低剂量组大鼠心肌纤维间可见较多出血渗出物，但较模型组病变程度轻；蒙药绍沙七味丸中剂量组大鼠病变程度轻于蒙药绍沙七味丸低剂量组，部分心肌纤维排列紊乱、松散、心肌纤维断裂、细胞核固缩，心肌纤维间可见出血、渗出物；蒙药绍沙七味高剂量组大鼠病变程度轻于蒙药绍沙七味丸中剂量组，心肌纤维间可见少量出血、渗出物，极少量炎症细胞；复方丹参片组大鼠病变较为严重，心肌纤维排列紊乱、松散、纤细、心肌纤维断裂、细胞核固缩，心肌纤维间可见出血、渗出物、炎症细胞。

2.4 各组大鼠心脏组织NF-κB蛋白表达量比较NF-κB表达位于细胞质和少部分细胞核，细胞核用苏木精复染阴性为蓝色，阳性紫黑色。免疫组化半定量分析显示，模型组大鼠心脏组织NF-κB蛋白表达量明显高于正常组（P〈0.01）；蒙药绍沙七味丸中剂量组和复方丹参片组大鼠心脏组织NF-κB蛋白表达量明显低于模型组（P〈0.05），蒙药绍沙七味丸低、高剂量组大鼠心脏组织NF-κB蛋白表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠心脏组织NF-κB蛋白表达的平均光密度值比较（±s）

表3 各组大鼠心脏组织NF-κB蛋白表达的平均光密度值比较（±s）

注：与正常组比较，aP〈0.01；与模型组比较，bP〈0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）NF-κB正常组 6 - 109.78±10.88模型组 6 - 173.19±14.20a蒙药绍沙七味丸低剂量组6 0.80 162.10±11.37蒙药绍沙七味丸中剂量组6 1.60 159.60±10.02b蒙药绍沙七味丸高剂量组6 3.20 161.32±10.90复方丹参片组 6 0.25 161.39±9.58b

图1 各组大鼠心脏组织病理切片图（HE，×400）

3 讨 论

心肌缺血损伤是一种复杂的病理过程，急性心肌梗死也是一种炎症过程，而细胞因子在炎症反应过程中起着非常重要的作用，炎症反应过度表达是心肌损伤的主要机制之一。IL-6和TNF-α为众多炎症细胞因子中比较特别的[7]，都是重要的炎症介质，当心肌缺血发生时，可引起TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子释放，促使中性粒细胞向损伤区域聚集，组织浸润增加，从而引发炎症反应，同时产生大量自由基，加剧组织损伤[8-9]。IL-6在炎症反应中起核心调节作用，IL-6基因表达的多态性可影响机体炎症、免疫反应程度，与冠心病发病的易感性有关，是冠脉斑块炎症事件重要的局部和循环标记物，被认为是冠心病发病的重要候选基因之一[10]。TNF-α可引起肿瘤组织出血性坏死，是一种促炎性细胞因子，主要由激活的单核-巨噬细胞产生，具有广泛的生物学效应及生物学功能。在应激状态下，TNF-α在心肌大量表达，可以通过多种途径影响心肌功能，启动信号转导系统，并造成心肌损伤[11]。在各种心脏疾病如心肌缺血/再灌注损伤、缺血预处理、不稳定型心绞痛、充血性心力衰竭、心肌炎及扩张性心肌病等都存在NF-κB激活[12]。NF-κB通过对多种炎症相关的细胞因子、黏附分子等基因的转录调控，导致心肌炎症反应，促发凋亡、坏死、心功能衰竭等，导致心肌缺血损伤，它的激活与抑制直接关系到炎症损伤的进展与预后[13]。心肌缺血时，TNF-α、IL-6往往共同发生作用，在激活的心肌组织细胞可分泌多种细胞因子，这些细胞因子共同发挥强大的致炎作用，且通过NF-κB信号转导系统调节心肌细胞的功能。

蒙药绍沙七味丸中广枣中的黄酮类及有机酸等成分的存在使其具有多种生理活性，包括抗心律失常作用、保护缺血心肌作用、影响血液动力学、抗氧化、增强免疫力等生理活性[14]；原儿茶酸具有降低心肌耗氧量，提高心肌耐缺氧能力作用，可降低冠脉阻力，显著缩小心肌梗死范围[15]。野牦牛心（由于野牦牛为国家保护动物，野牦牛心药材稀缺，故多用牛心，兔心替代）富含的甘氨酸[16]、精氨酸[17]等均具有保护心脏、治疗缺血性心脏病、改善心功能等作用。辅药肉豆蔻挥发油可减慢心率，降低心律失常的发生率，同时降低心肌细胞损伤所释放的GOT、CK、LDH的含量，降低MDA和升高SOD的活性，从而对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[18]。木香有效成分主要为萜类、生物碱、蒽醌、黄酮等，能保护心脏，治疗缺血性心脏病。低浓度的木香挥发油对离体兔心有抑制作用。从木香挥发油中分离出的成分均能不同程度地抑制豚鼠、兔和蛙的离体心脏活动[19]。阿魏具有保护心血管，以及增加心率的作用[20]。

本研究中，蒙药绍沙七味丸各给药组均可不同程度地降低冠状动脉结扎复制大鼠急性心肌缺血模型大鼠的血清CK-MB、LDH含量，并能不同程度地下调血清IL-6、TNF-α水平和心脏组织NF-κB蛋白的表达，从而改善心脏组织的病理改变。蒙药绍沙七味丸对急性心肌缺血损伤有一定的保护作用，其中蒙药绍沙七味丸中、高剂量组作用更佳，低剂量组作用其次。蒙药绍沙七味丸的抗炎症机制可能与IL-6、TNF-α炎症因子水平与NF-κB蛋白的表达有关。

图2 各组大鼠心脏组织NF-κB表达情况（免疫组化，×400）