丹酚酸B诱导血管新生对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制及凋亡相关蛋白研究*

张爱婷，王春光，要 彤，赵小祺，张文婷

（1.河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000；2.河北北方学院基础医学院，河北 张家口 075000）

据《中国心血管健康与疾病报告2019》报道，我国心血管发病率逐年增长，危险因素流行趋势明显，控制状况仍不容乐观，未来10年仍将展现快速增长的态势[1]。心血管病负担逐渐加重，已经成为当今重大的公共卫生问题。随着冠状动脉血运重建技术的发展，多种治疗方法在冠心病的治疗中取得显著的效果。但是缺血心肌恢复血流灌注可能引发再灌注损伤，甚至造成可逆的心肌细胞损伤，降低临床治疗效果，该现象被称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemio-reperfusion injury，MIRI）[2]。MIRI的发病涉及细胞凋亡、炎症反应、氧自由基等多种机制，均可损害微血管内皮功能，加重心肌缺血，最终导致微血管病变[3]。因此，MIRI防治工作的关键在于改善冠状动脉微循环。丹参是传统中药材，在各种心血管病的治疗中均有广泛应用。丹酚酸B是丹参主要有效水溶性成分，可抑制血小板聚集，抑制血栓形成[4]，但对MIRI影响的相关研究并不多见。本研究通过观察丹酚酸B诱导血管新生对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制及凋亡相关蛋白质组学的影响，探讨其可能的作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄SPF级SD健康雄性大鼠40只，体质量（200±20）g，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（京）2018-0011。饲养条件：温度23～25℃，相对湿度50%～60%，自然光照，自由饮水、饮食。动物实验经医学实验动物管理委员会批准，批准号：JN.No20191030b0480130，所有操作均严格遵循实验动物管理相关规定。

1.2 药物与试剂 丹酚酸B（批号：201523，上海一基实业有限公司）；培哚普利片（批号：201108，法国Les Laboratoires Servier Industrie公司）；水合氯醛（批号：20151205，美国Sigma-Aldrich公司）；血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）ELISA试剂盒（批号：20180519）、前列腺素（prostacyclin，PGI2）ELISA试剂盒（批号：20180735）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA试剂盒（批号：20190238）（上海联硕生物科技有限公司）；B细胞淋巴瘤/白血病2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（批号：20191228）、B细胞淋巴瘤/白血病2关联（Bax）（批号：20181232）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）（批号：20190128）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（批号：20190517）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批号：20190505）（上海酶联生物）；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（批号：20181010，北京索莱宝科技有限公司）；荧光上样缓冲液（SDS-PAGE）（批号：201917，美国EZBiolab公司）。

1.3 主要仪器SAR-830-P型小动物呼吸机（美国CWE公司）；WHL-30B型电热恒温干燥箱（广东佛衡仪器有限公司）；ECGenie型动物无创心电图分析系统（美国Mouse Specifics Inc公司）；SW-CJ-2D型超净工作台（北京华威兴业科技有限公司）；DMD108型光学显微镜（德国徕卡公司）；AVANTI J-15R型高速冷冻台式离心机（美国Beckman Coulter公司）；OmegaLum C型化学发光凝胶成像系统（美国Aplegen公司）；DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪（槽）（北京六一生物科技有限公司）；NanoDrop型微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司）。

1.4 分组与给药[5]将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、培哚普利组和丹酚酸B组，每组10只。培哚普利组大鼠腹腔注射培哚普利片溶液，0.4 mg/kg；丹酚酸B组大鼠腹腔注射丹酚酸B溶液，50.0 mg/kg[5]；模型组和假手术组大鼠腹腔注射等量生理盐水。造模前3 d开始给药，1次/d，造模完成后停止给药。

1.5 造模方法 假手术组大鼠仅开胸分离左冠状动脉前降支，不进行血流阻断和再灌注处理；其余大鼠建立MIRI模型，具体操作：10%水合氯醛麻醉，采用多导生理记录仪进行心电图监测，气管插管连接小动物呼吸机；左侧第三、四肋间切开皮肤，逐层分离后打开胸腔，充分暴露心脏；左心耳根部下方3～4 mm处进针，向肺动脉圆锥方向出针，将15 mm聚乙烯管置于结扎结下，收紧结扎线阻断左冠状动脉前降支血流。手术严格执行无菌操作，过程中监控大鼠心率、呼吸变化。以心电图显示ST段抬高或T波高耸为结扎成功，心肌缺血0.5 h后剪段结扎线；再灌注2 h后恢复冠脉血流，抬高的ST段降低1/2以上为MIRI造模成功。

1.6 实验取材与处理 各组大鼠灌注2 h后即刻经大鼠腹主动脉取血浆，离心分离后取上清液保存待检；取血后采用断头法处死大鼠，无菌条件下取出心脏，经生理盐水冲洗后重新阻断左冠状动脉前降支并从颈动脉注入1%伊文思蓝2 mL，分离左心室组织，滤纸吸干后-20℃冰箱内保存10 min后，取出切成2 mm左右厚度的心肌组织切片；采用甲醛固定，置于液氮中，-20℃冻存。

1.7 观察指标

1.7.1 心肌组织病理学观察 取缺血心肌组织，戊二醛固定2 h后采用PBS清洗，石蜡包埋与切片；二甲苯脱蜡，梯度乙醇洗脱，加入蒸馏水后加入苏木素和伊红（HE）染色，无水乙醇脱水后使用中性树胶封固，于光学显微镜下拍照、观察。

1.7.2 ELISA法检测大鼠血清中VEGF、TAX2、PGI2水平 酶标板上预设定6个标准品孔、待测样品孔和空白孔；经加样、配液、洗涤、显色、终止、测定等程序，根据标准品浓度和450 nm处吸光度计算回归曲线，根据样品的吸光度得到VEGF、TAX2、PGI2样品浓度。所有过程均严格按照试剂盒说明书执行。

1.7.3 测定心肌梗死面积 将心肌组织置于PBS缓冲液（含1%TTC，pH值为7.4）中37℃水浴15 min，光学显微镜下观察心肌组织。存活心肌表现为蓝色，缺血心肌表现为红色，梗死心肌表现为苍白色。甲醛固定24 h后使用相机拍照，使用Image图像分析软件计算心肌梗死面积。

1.7.4 TUNEL法测定心肌细胞凋亡率 将心脏置于PBS溶液中，分离缺血区心肌，洗净后采用甲醛固定，24 h后取出。用乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，按TUNEL试剂盒说明书步骤执行检验操作。染色后在光学显微镜下观察细胞凋亡情况，细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。计算每100个细胞中凋亡细胞个数，计算细胞凋亡率。每个切片随机选择5个视野，取平均数。

1.7.5 Western blotting法测定Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表达 取10 mg各组大鼠心肌组织剪碎后加入RIPA裂解液和蛋白抑制剂，0℃水浴匀浆后转移至预冷的1.5 mL EP管，充分裂解后，离心、分离弃置上清液；取少量蛋白质样品采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，分光光度计比色，绘制标准蛋白曲线，经比色后得到蛋白质浓度，其余样品-80℃冻存。采用10%SDS-PAGE凝胶，0.5%琼脂糖封胶，进行垂直电泳槽电泳；PVDF转膜，封闭后加入一抗液（1:1 000），4℃孵育过夜；次日采用PBS清洗3次，加入二抗（1:5 000），封口孵育2 h，PBS洗膜3次；加入到增强化学发光试剂中显色5 min，曝光后检测灰度值。以目标蛋白与GAPDH灰度值的比值作为Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax相对表达水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法检验。以P〈0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠死亡情况 假手术组大鼠手术过程中死亡3只；模型组大鼠造模过程中死亡2只，未达到MIRI标准2只；培哚普利组大鼠造模过程中死亡3只，未达到MIRI标准2只；丹酚酸B组大鼠造模过程中死亡1只，未达到MIRI标准3只。大鼠死亡原因主要是大出血和呼吸停止。

2.2 各组大鼠心肌组织病理学改变情况 假手术组大鼠心肌细胞大小、形态正常，结构完整，未见梗死区域；模型组大鼠心肌结构不完整，细胞界限不清晰，细胞核脱落，可见炎性浸润；培哚普利组和丹酚酸B组大鼠心肌组织病理学改变情况较模型组有明显改善，结构较完整，大小、形态相对正常。（见图1）

图1 各组大鼠心肌组织病理学改变比较（HE，×400）

2.3 各组大鼠心肌梗死面积比较 模型组大鼠心肌组织总面积、心肌组织梗死面积、梗死面积比例均高于假手术组（P〈0.05）；培哚普利组、丹酚酸B组大鼠心肌组织梗死面积、梗死面积比例均低于模型组（P〈0.05）；丹酚酸B组大鼠心肌组织总面积、心肌组织梗死面积、梗死面积比例与培哚普利组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较（±s）

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较（±s）

注：与假手术组比较，aP〈0.05；与模型组比较，bP〈0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）总面积（cm2）梗死面积（cm2）梗死面积比例（%）假手术组 7 - 4.96±0.22 0 0模型组 6 - 5.45±0.30a 1.25±0.18a 22.94±5.12a培哚普利组5 0.4 5.38±0.27 0.83±0.14b 15.43±4.40b丹酚酸B组 6 50.0 5.35±0.29 0.86±0.15b 16.07±4.15b F 4.433 12.595 4.757 P 0.015 0.000 0.027

2.4 各组大鼠心肌凋亡率比较 假手术组大鼠未见明显心肌细胞凋亡，模型组大鼠心肌细胞凋亡明显，培哚普利组和丹酚酸B组大鼠与模型组比较有所改善，但仍见少量凋亡细胞。（见图2）模型组大鼠心肌细胞凋亡率高于假手术组（P〈0.05）；培哚普利组、丹酚酸B组大鼠心肌细胞凋亡率低于模型组（P〈0.05）；丹酚酸B组大鼠心肌细胞凋亡率与培哚普利组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见表2）

图2 TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况（×100）

表2 各组大鼠心肌凋亡率比较（±s，%）

表2 各组大鼠心肌凋亡率比较（±s，%）

注：与假手术组比较，aP〈0.05；与模型组比较，bP〈0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg） 细胞凋亡率假手术组 7 - 0.31±0.04模型组 6 - 43.65±5.82a培哚普利组 5 0.4 20.18±1.65b丹酚酸B组 6 50.0 21.45±1.82b F 205.761 P 0.000

2.5 各组大鼠血清中VEGF、TAX2、PGI2含量比较 模型组大鼠血清中VEGF、PGI2含量低于假手术组（P〈0.05），TAX2含量高于假手术组（P〈0.05）；培哚普利组和丹酚酸B组大鼠血清中VEGF、PGI2含量高于模型组（P〈0.05），TAX2含量低于模型组（P〈0.05）；丹酚酸B组大鼠血清中VEGF含量高于培哚普利组（P〈0.05），TAX2含量低于培哚普利组（P〈0.05）；丹酚酸B组大鼠血清中PGI2含量与培哚普利组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠血清中VEGF、TAX2、PGI2含量比较（±s，ng/L）

表3 各组大鼠血清中VEGF、TAX2、PGI2含量比较（±s，ng/L）

注：与假手术组比较，aP〈0.05；与模型组比较，bP〈0.05；与培哚普利组比较，cP〈0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）VEGF TAX2 PGI2假手术组 7 - 105.68±9.85 30.28±1.51 61.74±5.59模型组 6 - 35.16±5.12a 58.38±1.35a 35.62±5.18a培哚普利组 5 0.4 72.39±6.74b 44.52±1.43b 55.16±5.74b丹酚酸B组 6 50.0 85.96±6.82bc 39.81±0.96bc 50.34±5.37b F 99.534 481.547 25.834 P 0.000 0.000 0.000

2.6 各组大鼠心肌组织中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 模型组大鼠心肌组织中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量高于假手术组（P〈0.05）；培哚普利组和丹酚酸B组大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白相对表达量高于模型组（P〈0.05），Caspase-3、PI3K、Bax蛋白相对表达量低于模型组（P〈0.05）；丹酚酸B组大鼠心肌组织中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量与培哚普利组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。（见表4、图3）

图3 各组大鼠心肌组织中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白电泳图

表4 各组大鼠心肌组织中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组大鼠心肌组织中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，aP〈0.05；与模型组比较，bP〈0.05

组别 动物数（只）给药剂量(mg/kg)Caspase-3 PI3K Bcl-2 Bax假手术组 7 - 0.21±0.03 0.15±0.01 0.51±0.03 0.18±0.02模型组 6 - 0.68±0.10a 0.64±0.05a 0.70±0.05a 0.75±0.11a培哚普利组 5 0.4 0.35±0.04b 0.28±0.03b 0.83±0.10b 0.32±0.06b丹酚酸B组 6 50.0 0.38±0.05b 0.30±0.02b 0.85±0.09b 0.35±0.05b F 66.217 292.369 31.855 83.146 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨 论

冠状动脉介入、冠状动脉搭桥、溶栓等是临床上治疗急性心血管病的常用治疗手段，可有效恢复心肌缺血细胞的血供，但MIRI的发生使其未达到预期疗效。MIRI是心肌血供中断一定时间后恢复血供造成的严重的损伤，会导致患者出现心功能不全、血压骤降、心律失常等症状，导致病情恶化，甚至可能导致患者猝死。缺血预处理是通过短暂阻断冠状动脉血流对随后较长时间的心肌缺血再灌注损伤产生保护作用，但目前的缺血预处理具有创伤性，会提高治疗风险，很难在临床中应用。因此，药物性预处理的延迟性保护作用近年来逐渐成为研究的热点。

中医对于心血管疾病，尤其是缺血性心脏病以活血、化瘀、止痛为基本治疗原则。丹参是我国传统中药材，具有活血祛瘀、通经止痛的功效[6]；丹酚酸B是丹参主要成分，可通过多种途径发挥抗心肌缺血的作用[7]。本研究显示，经丹酚酸B处理后的大鼠心肌组织梗死面积、梗死面积比例均降低（P〈0.05），且与培哚普利组比较，差异无统计学意义（P〉0.05），证实丹酚酸B能够降低MIRI大鼠模型心肌损伤，对心肌细胞具有保护作用，与杨华等[8]研究结果具有一致性。尽管多种研究证实，丹酚酸B对机体损伤部位具有保护作用，但其具体机制尚未完全清楚。

完整的血管内皮细胞层在调控血管渗透性、血小板黏附等方面具有重要作用[9]。任何因素引起的内皮细胞受损都可能引起内皮功能障碍，而内皮功能障碍是心血管病疾病发生的关键因素[10]。MIRI发生后血管内皮功能损伤，导致心肌细胞能量代谢障碍，产生大量氧自由基。VEGF是一类同源二聚体糖蛋白，对促进微血管新生和成熟具有重要作用。VEGF及其受体可有效提高血管通透性，促进血管内皮细胞增殖、迁移，促进心血管的形成，并且广泛参与细胞增殖、分化、抗炎、抗凋亡和促血管新生等过程[11]。TAX2和PGI2是前列腺素类重要因子，由花生四烯酸经环氧化酶催化形成，是调节血管壁紧张性的主要活性物质。TAX2常被用作血管收缩剂，可促进血小板聚集和血管收缩[12]。PGI2是血管保护因子，具有抑制血小板聚集、舒张血管、对抗TAX2的作用[13]。正常情况下，二者处于动态平衡，共同维护血管的稳定。一旦发生缺血缺氧致内皮细胞受损，就会导致TAX2释放增多，PGI2生成减少，引起血管收缩，诱发冠状动脉痉挛，同时提高血管通透性。本研究显示，经丹酚酸B处理后的大鼠VEGF、PGI2含量升高（P〈0.05），TAX2含量降低（P〈0.05），证实丹酚酸B可促进微循环血管生成，改善内皮功能和冠状动脉微循环障碍，对抗凝血和血栓的形成。

细胞凋亡是基因控制的细胞主动死亡过程，是机体发生的细胞生理性死亡现象，对生长、发育和维持机体内环境稳定具有重要作用。同时细胞凋亡也是导致血管内皮功能障碍的重要原因，30%～50%的内皮细胞死亡源于细胞凋亡。当机体遭受应激伤害时会启动一系列的防御机制而产生保护作用。MIRI引起的乳酸、一氧化氮堆积等均会加速正常细胞的凋亡[14]。本研究中，经丹酚酸B处理后的大鼠心肌细胞凋亡率明显降低（P〈0.05），证实丹酚酸B可有效抑制细胞凋亡。细胞凋亡过程由多种基因蛋白表达调控。细胞凋亡分为内源性凋亡和外源性凋亡两种途径。Bcl-2家族是细胞凋亡内源性线粒体通路的重要调节因子。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族主要成员，是早期被发现的参与细胞凋亡的蛋白，是反映心肌生存能力的重要指标[15]。Bcl-2是抑制凋亡蛋白，主要存在于细胞线粒体膜、核膜等，通过维持Ca2+的动态平衡抗拮促凋亡蛋白的表达；Bax是促凋亡蛋白，也是Bcl-2同源基因蛋白，通过抑制Bcl-2损伤线粒体，抑制线粒体信号通路启动，从而促进细胞凋亡。MIRI会诱导细胞凋亡，阻断启动抗凋亡的信号通路。PI3K/Akt信号通路广泛存在于真核细胞中，参与细胞激活，调控蛋白质代谢，可作用于Bcl凋亡家族。Caspase-3被称为细胞凋亡的执行者，正常情况下，Caspase-3以酶原的形式在细胞质中存在，并不具备活性，在凋亡发生的早期阶段被激活，裂解胞质、胞核底物，启动细胞凋亡[16]。本研究显示，模型组大鼠心肌组织中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量高于假手术组（P〈0.05），证实上述凋亡蛋白在MIRI中均异常表达。经丹酚酸B处理后，心肌组织中Bcl-2蛋白相对表达量升高（P〈0.05），Caspase-3、PI3K、Bax蛋白相对表达量降低（P〈0.05），提示丹酚酸B可能通过抑制Caspase-3、PI3K、Bax蛋白，上调Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡。综上所述，丹酚酸B对心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能通过诱导血管新生、抗凋亡实现。